11.样品制备和预处理

1、1. 样和预处理DHPLC DNA 同源双链和杂合双链从色谱柱上的洗脱PCRDHPLC 色谱图峰型相DNA分子（DNA分子一条单链含突变DHPLC 分析样品是 纯化的PCR 扩增产物，杂合突变样品可直接用于分样品的处理：PCR 产物经1. 样和预处理DHPLC DNA 同源双链和杂合双链从色谱柱上的洗脱PCRDHPLC 色谱图峰型相DNA分子（DNA分子一条单链含突变DHPLC 分析样品是 纯化的PCR 扩增产物，杂合突变样品可直接用于分样品的处理：PCR 产物经955min，然后，大约以每分钟1的速度将温至 45以下，以充分形成杂合双链。2. DHPLC 检测所需要的 PCR 产物最低进样量

2、DHPLC 是一种灵敏的突变检测技术，对PCR 高。PCR，且特异性差时，DHPLC的色谱图常不易判断；PCR增产物含量增加，往往导致DHPLC 分辨能力的下降，或形成异常峰型，容易导减少扩增循环数，比如 30 个循环。3PCR 产物的大小虽然DHPLC分析的DNA150-800bp4. PCR PCR 下：1 GC分布比较均匀；2 尽量使GC 含量高的区域在扩增片段的两端；3 在检测GC 含量区域的突变时，有时可能需要在引物的 5端加 GC 夹。在设计引物时，最好使您感 的区域距扩增片段两端约 30-50bp 以上。5. 阳性结果的判断由于不含突变位点的PCR 产物（野生型PCR 产物）只有

3、单一成分（即同源DNA 分子），DHPLC 图谱上呈现为单一峰型（同源双链峰，Homoduplex peak）。含突变成分的 PCR 产物，经变性、退火处理后形成了异源双链和同源DNA DNASep检测柱的结合能力较双链 DNA 分子低，优先被洗脱液洗脱下来，形成异源双链峰（Heteroduplex peak）PCR片段DHPLCDHPLC 可检出的 PCR 产物中突变成分最少百分含量在含突变成分的PCR产物中，DHPLC能检出的突变产物的最低量（百分含量）是评价DHPLC 灵敏性的一项重要指标。DHPLC 能灵敏地识别PCR混合物中突变成分的最低含量为 5%左右。当 PCR 混合物中突变 D

4、NA 分子达到 10%以PCRDHPLC 是最近几年才发展起来的一比如，检测温度、PCR引物设计、PCRDNA 聚合酶是 DHPLC 突变检测的一个重要影响。DNA 聚合酶对DHPLC 提高 PCR 扩增的保真性，Pfu DNA 聚合酶通常是优先选用的品种。对于小于 250bp 的片段，当PCR 比如，检测温度、PCR引物设计、PCRDNA 聚合酶是 DHPLC 突变检测的一个重要影响。DNA 聚合酶对DHPLC 提高 PCR 扩增的保真性，Pfu DNA 聚合酶通常是优先选用的品种。对于小于 250bp 的片段，当PCR 循环数与碱基数的乘积10000 时，Taq 或Taq Gold 聚合酶

5、也能获得保真性较高的PCR 产物。目前国内用户为降低成本，常选择普通的Taq 酶，有些公司的酶效果较好，PCR 免成分不明的试剂（PCR稳定剂，增强剂，添加剂等）；DNA 模板掺入的有害杂质；矿物油；甲酰胺；高压灭菌水；蛋白酶 K；牛 Betaine(甲铵乙内酯)等。检测含有上述成分的样品时，只能采用“Active clean”模式清 接通电源接通计算机和WAVE 系统的各 示面板显示“D-Line Not ready”。系统初始化打开“Navigator operatioInitialize”钮，等到五个设置柱箱温度按柱箱面板上的“Set/Monit”键，然后按上下箭头键设置到所需的温度要求

6、在开泵之前，温度达到 40，但溶液除气泡一般设置在 50以上，设置为至少 10ml 溶液，然后再接上管道，每次新换溶液后，都要对相应的管道进行高压泵除气泡 冲洗进样器按自动进样器面板上的“WASH”键，冲洗进样器以排除23次。系统平衡冲洗进样器按自动进样器面板上的“WASH”键，冲洗进样器以排除23次。系统平衡按高压泵面板上的“MANUALSET”键，并且设置“50%”溶液B，按 “ENTER” 键二次使溶液 C 和溶液 D 为“0%”。将液体流速项设置 设置温度后，按“PUMP ON/OFF10 分钟。然后依照相打开D-7000 HSM Administration 界面，点击“Application setup”钮， Directory钮后，关闭D-7000 HSM Administration 界面。打开 WAVEMAKER，在 WAVE 操作系统中，编制样品表“S 10. 启动样品检测程序中，按“Run le Tablele1. ：流速 0.9ml/min，这时系统的压力应超过 400psi。将DNASep 柱反向重新接到系统上 A50%将DNASep 柱正向重新接到系统上。WAVE 2. 3个工作日仪器不使用，需要卸下DNASep。2. 3个工作日仪器不使用，需要卸下DNASep。卸下DNASep 柱。3. 异丙醇冲洗液：50%的异丙