细胞信号转导研究方法课件

1、信号转导的研究方法生物样品的处理组织样品 采集：新鲜、未污染，剥去脂肪和筋皮等结缔组织 若保存，液氮速冻，-80冻存蛋白质成分的保护 通常在生物样品中加入适量的蛋白酶抑制剂：PMSF（苯甲磺酰氟）、EDTA、胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂和亮抑蛋白酶肽。低温保存：根据蛋白质的用途决定保存温度：4、-20还是-80，特殊要液氮冻溶： -20或-804（一天） 室温 均匀摇晃，勿产生气泡，减少沉淀组织提取物的制备：提取可溶蛋白（尽可能选择含目标蛋白高的组织）步骤及注意事项：1、切成小块，放入预冷匀浆器，加入预冷缓冲液（2倍体积）2、匀浆1-3min，若较长时间，则间隔1min3、匀浆方法选择：有的

2、组织在匀浆前先冷冻后有利于破碎；人工匀浆4、缓冲液的选择：使用中性PH、离子强度适当5、抑制蛋白酶的加入：根据蛋白质的可能降解情况加入（酶抑制剂价格昂贵）6、低温高速或超速离心7、超声的方法细胞破碎与分离破碎方法：机械法：非机械法：溶胞作用：酶溶法、化学法、物理法酶溶法：用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解 常用：溶菌酶、-1,3葡聚糖酶、蛋白酶等； 缺点：价格高，通用性差信号转导的研究方法 受 体 突变株的筛选（遗传学方法） 受体提纯（亲和层析） 标记配体法检测受体： 受体与配体相互作用研究方法 ：（1）饱和实验，用于测定放射性配体对受体的亲和力（K）以及结合位点的密度（Bmax）；（2）抑制实

3、验，用于测定未标记的竞争配体与受体的亲和力（Ki）；（3）动力学实验，用于测定放射性配体与受体的结合速率常数（K+1）和解离速率常数（k-1）。亲和标记法分离表面受体亲和标记（affinity labeling）是常用的分离细胞表面受体的方法原理： 将细胞与超量标记的激素（配体）混合，以饱和所有特异受体的激素结合位点。洗去多余的激素，然后加入能够与受体和配体结合的共价交联剂将激素与受体进行共价交联。亲和标记胰岛素受体大多数交联剂含有两个可与蛋白质中自由氨基相互作用的基团， 当表面受体与配体结合后，配体和受体上各自的自由氨基的距离靠近到足以被小分子的交联剂结合时，受体和配体就会被交联在一起。与交

4、联剂共价结合的配体和受体能够耐受去垢剂和变性剂的处理。因而可用去垢剂和变性剂溶解细胞质膜，分离膜蛋白通过电泳进行分析。核受体作用的DNA元件研究方法Chip on Chip 纯化的受体制备抗体 CHIP 特异核酸序列与已知序列的基因芯片杂交受体结合的核酸序列G蛋白药理学激活剂及抑制剂 非水解的GTP类似物激活剂：-S-GTP、,-亚氨基GTP，与活化G蛋白混合，使G蛋白持续活化状态 细菌毒素-霍乱毒素激活剂：ADP核糖基共价结合亚基，不可逆修饰，结合GTP，但不能水解 GDP类似物抑制剂：GDP S，结合亚基的鸟苷酸位点，广泛应用环核苷酸信使系统cAMP/cGMP定性及定量测定 3H/125I

5、标记cAMP/CGMP竞争结合分析系统 酶联免疫方法（ELISA) 色谱分离-质谱测定 细胞内实时测定：荧光共振能量转移（FRET）及生物分子荧光互补（BIFC）cAMP3H分析系统，优点是放射性半衰期长，可用于大量样品的分析；cAMP125I分析系统，用于小量样品的分析；cAMP ELISA测定方法，测定简便、敏感性高（特异受体） 。cAMP信号系统常用药理学试剂cAMP类似物：竞争性结合PKA调节亚基上的cAMP结合位点，PKA的竞争拮抗剂，PDE不能水解，Rp-cAMP、Sp-CAMP与PKA的底物结合位点竞争的抑制剂：结合C亚基的ATP结合位点，抑制专一性低，异喹啉衍生物H89、KT5

6、720蛋白激酶抑制剂（PKI）：结合C亚基的底物结合位点，细胞内源：、三种亚型，人工合成PKA抑制肽（高浓度时对PKG的影响）cGMP信号系统常用药理学试剂 人工合成的cGMP类似物：8-Br-cGMP，直接激活PKG sGC抑制剂：NS2028 PKG抑制剂：KT5823脂质代谢的常用方法同位素示踪：通过标记32P磷脂分子的定性和定量：色谱、质谱的应用 脂组学DAG的测定 提取含DAG的样品，用DAG激酶催化底物DAG，使之发生磷酸化，外源加入32-ATP，最后将反应产物进行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含量（Amersham公司生产的DAG分析系统）。钙信号细胞内游离

7、钙离子测定方法方法选择：1、使用Ca2+特异性指示剂时，指示剂与Ca2+专一结合性强、亲和力高，可以测定低浓度Ca2+ ；2、尽可能获得Ca2+浓度绝对值；3、测定Ca2+水平的变化比细胞内Ca信号引起的相关生理反应要快；4、指示剂与Ca2+结合不损害细胞内正常生理生化过程；5、容易进入细胞并在胞质内扩散；6、有可能显示胞内Ca2+分布。 Ca2+ i的测定 细胞内Ca2+的测定方法有原子吸收光谱法、离子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。荧光探针的装载方法： 显微注射：水母发光蛋白和Dextran偶联的探针 酸化导入法：离子型探针（有些细胞无法导入） 常温孵育法：AM酯化的探针（在动物细

8、胞应用广泛） 低温导入法：植物细胞，低温抑制细胞壁的酯酶荧光测定仪器 荧光分光光度计：少用 流式细胞仪： 激光扫描共聚焦显微镜术（LSCM） 数字共聚焦显微镜Fluo 3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与钙离子Ca2+结合后荧光会增加60至80倍，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526 nm。是目前最常用的一种钙离子荧光探针。Fluo 3-AM是Fluo 3的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。 Fluo 3-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo 3，从而被滞留在细胞内。激光共聚焦荧光显微镜具有氩激光器，所以Fluo 3可被广泛使用于这种显微镜

9、上。这种荧光信号发出来的长波也便于减小对样品细胞的光损伤。钙调素的定量测定 酶法：根据CaM依赖的酶（PDE、NAD激酶、Ca-ATP酶等）激活的程度，使用广泛 免疫学法：RIA和ELISA（抗体，特异性强、测定CaM的总量，非活性）磷酸化的信号转导分子酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化蛋白鉴定通常是首先分离粗提蛋白，采用针对含这些氨基酸残基磷酸化蛋白的单克隆抗体进行免疫沉淀,SDS电泳，然而采用Western blotting鉴定其分子量，进一步利用分子生物学技术克隆信号蛋白，搞清其基因结构和氨基酸序列。免疫学法蛋白质印迹：抗体（如抗p-Thr）、样品匀浆液加入蛋白酶抑制剂、蛋

10、白磷酸酶抑制剂或蛋白激酶抑制剂；目标蛋白印迹发生移位免疫组织化学：磷酸化蛋白在亚细胞定位和动态变化流式细胞术：荧光抗体磷酸化蛋白组学 高分辨率质谱 磷酸酶抑制剂使用：钒酸钠（酪氨酸磷酸酶）、冈田酸（丝/苏氨酸磷酸酶）、氟化钠、焦磷酸钠、甘油磷酸钠（广谱、非特异磷酸酶）激酶活性的测定 常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。检测原理：根据激酶可以催化特定底物发生磷酸化，外源加入32-ATP，通过分离反应产物后测定放射活性，从标准曲线推算出样品酶的活性。PKC从胞质向胞膜的转位是PKC活化的一个重要指标，因而分离胞质和胞膜中的PKC并分别测定其活性，计算胞膜上PKC活

11、性占总PKC活性的比例，从而判定PKC的活化程度。蛋白质表达水平和细胞内定位研究信号蛋白分子表达水平及分子量检测 western blot analysis信号蛋白分子在细胞内定位研究 immunohistochemistry/immunnocytochemistry Immunofluorescence（IF） Green fluorescent protein（GFP ，live cells）western blotSDS转膜（PVDF or NC） 封闭一抗洗涤标记二抗洗涤显色或化学发光显影SDS作用：确定蛋白质纯度、确定蛋白质亚单位的分子量考染：检测含0.1ug蛋白质条带 银染：灵敏度

12、高100倍印迹膜上蛋白质染色：聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜氨基黑染色：蛋白质测序和蛋白质原位切割，首选染料（检测最小量：50ng）考染：除NC膜外（50ng）丽春红S：适用印迹膜用于二次检测（western blot） （200ng），条件摸索成熟后，不建议染色胶体金、胶体银、印度墨汁、荧光胺标记检测目标蛋白： 结合PAGE的高分辨率和固相免疫反应的高特异性，可检测1-5ng、中等分子量的靶蛋白上样量：目标蛋白量不应太低膜的选择：蛋白质的分子量（孔径）封闭液：20%BSA10%脱脂奶粉10%马血清 抗体：内参检测系统：辣根过氧化物酶-ECL结果分析：背景过高：洗膜不充分、抗体浓度过高、封

13、闭不充分；条带过浅：抗体浓度不够、效价降低、曝光过短、蛋白含量低Stripping buffer漂洗，去除一结合的一抗和二抗，多次使用免疫荧光技术Immunofluorescence（IF）利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其他蛋白结合制备成荧光探针，然后与待测抗原或配体发生特异性结合，形成的复合物在一定的波长光的激发下，可产生荧光，利用荧光显微镜对抗原进行定性或定位的检测。采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群的蛋白质分子，用两种荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内检测两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种

14、分子检测。蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术Co-IP（免疫共沉淀) GST pull down assayYeast or mammalian two hybrid assayFRET （fluorescence resonance energy transfer assay)IP是利用抗原蛋白质与抗体的特异结合以及细菌蛋白“protein A”能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段而开发出来的方法。目前多用精制的protein A预先结合固化在agarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后， beads上的protein A就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。Agarosebe

15、adsprotein A抗原抗体免疫共沉淀（Co-IP）当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在胞内结合的蛋白y也能被沉淀下来。进一步通过western blot 和质谱分析。常用于测定两种目标蛋白在胞内是否结合用于确定一种特定蛋白的新的作用搭档但可能测定不到低亲和力和瞬间的蛋白-蛋白相互作用。优点：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白

16、质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果。注意的问题：（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂。（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体：染色体免疫共沉淀技术（ChIP）染色质免疫沉淀技术（chromatin immuno

17、precipitation assay, ChIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。基本原理：在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：Chip-on-chipChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选

18、。细胞核转录因子电泳迁移率改变分析:根据核转录因子可与一些特定的核苷酸序列结合的特点，将其特定的核苷序列标记上同位素，来鉴定信号转导中的核转录因子。并且采用足迹法(foot printing)分析新发现核转录因子结合DNA的位置和核苷酸序列。Chip 采用基因克隆技术发现了越来越多的信号蛋白分子； 嵌合分子的构建及基因转染等技术的应用为细胞因子的 信号转导研究提供了有效的手段； 点突变、肽竞争等技术使信号蛋白中某些功能区的作用的研究变得更为精确。细胞信号转导与疾病信号转导异常发生的环节和机制 一信息分子异常不足：如胰岛素生成减少，体内产生抗胰岛素抗体或胰岛素拮抗因子等，均可导致胰岛素的相对或绝

19、对不足，引起高血糖。过量：脑缺血、缺氧或创伤时谷氨酸释放增加，各氨酸在脑内大量聚集。导致谷氨酸天冬氨酸受体(NMDA受体)的过度激活。使Ca2+大量内流，可激活脂酶和蛋白酶等，导致细胞死亡。（由谷氨酸增多对神经系统产生的兴奋性毒性作用：脑的缺血性损伤，癫痫形成以及神经退行性变等）。病理性或损伤性刺激 病原体及其产物的刺激：如脂多糖(Lps)通过其受体启动细胞的信号转导通路 ：a.激活转录因子NF-； b.激活MAPK家族成员：JNK和P38MAPK。 1、遗传性受体病受体缺陷导致的疾病： 如家族性肾性尿崩症是ADH受体基因突变导致ADH受体合成减少或结构异常。受体过度激活导致的疾病： TSHR

20、与TSH结合后。能激活G- AC- cAMP- PKA通路、GqPLCDAGPKC通路及ERK通路等，导致甲状腺紊分泌和促进甲状腺增殖效应。 。 二、受体信号转导异常2、自身免疫性受体病：Grave病，重症肌无力患者体内发现有抗N型乙酰胆碱受体(nAChR的抗体）能阻断运动终板上的nAChR与乙酰胆碱结合，导致肌肉收缩障碍。 3、继发性受体异常：心衰时血中去甲肾上腺素浓度过高可使受体下调以及受体与G蛋白解偶联，使细胞内cAMP生成减少，导致去甲肾上腺素的正性肌力作用减弱 二、受体信号转导异常 如霍乱肠毒素能选择性催化小肠黏膜上皮细胞中的G亚基精氨酸ADP核糖基化，导致GTP酶活性丧失使G 处于

21、不可逆性激活状态，持续刺激腺苷酸环化酶(Ac)- cAMP- PKA，使水分不断进入肠腔，引起严重的腹泻和脱水。三、 G蛋白信号转导异常如在组织缺血-再灌注损伤过程中，胞浆Ca2+浓度升高，通过下游的信号转导途径引起组织损伤。四、细胞内信号的转导异常 在疾病的发生和发展过程中，可涉及多个信息分子影响多个信号转导途径，导致复杂的网络调节失衡。五、多个环节细胞信号转导异常如感染性休克发病过程中，在同一刺激源（内毒素）作用下使交感神经兴奋，若作用于受体，则引起动脉收缩表现为冷休克; 若交感神经兴奋激活受体，使动、静脉短路开放，则表现为暖休克。如心肌肥大的发病过程中，心肌负荷过重引起的机械刺激，神经体

22、液调节产生的去甲肾上腺素、血管紧张素等，通过不同的信号转导蛋白的传递，最终引起相同的病理反应心肌肥大。 六、同一刺激引起不同的病理反应七、不同刺激引起相同的病理反应 某些疾病的异常信号转导胰岛素受体(IR)为酪氨酸蛋白激酶(PTK)型受体。PTK激活通过胰岛素受体底物(IRS)激活PI一3K及RasRaf一MEKERK等多条信号转导通路，促进葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)转位到膜上，从而增加外周组织摄取葡萄糖的能力；使无恬性的糖原合酶转为激括的形式增加糖原的合成；使基因表达增强蛋白质合成增加、促进细胞的增殖等。一、胰岛素抵抗性糖尿病1、遗传性胰岛素抵抗性糖尿病一般有家族史，已报道了发生在该病患

23、者中约50多种胰岛索受体的基因突变，突变呈明显的异质性，以点突变为主，分布于受体的胞外区和PTK区。突变可导致受体合成障碍、受体往细胞膜运输受阻、受体与胰岛素亲和力下降、PTK活性降低及受体降解加快等。 2、自身免疫性胰岛素抵抗性糖尿病患者多为女性，合并其他自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮等。血中可测到抗胰岛素受体的抗体以阻断型为主，与受体结合后可阻断胰岛素与受体的结合及效应。3、继发性胰岛素抵抗肥胖患者通常摄人过量，使餐后血糖浓度明显增高，进而引起血中胰岛素浓度升高，长时间增高的胰岛素可通过下调作用使IR减少，导致靶细胞对胰岛素的敏感性降低严重的创伤、应激、感染时，大量产生的应激激素(如糖皮

24、质激素)和细胞因子(如TNF)等可通过干扰胰岛素受体后的信号转导途径及细胞内的代谢高血糖和运动不足等也可引起胰岛素抵抗性糖尿病。 二、肿瘤 肿瘤的早期主要是与增殖、分化、凋亡有关的基因改变晚期则是控制细胞黏附和运动性的基因发生变化使肿瘤细胞获得了转移性。 (一)促细胞增殖的信号转导过强 1、促细胞增殖因子产生增多：肿瘤分泌生长因子，如转化生长因子(TGF)、血小板衍生性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。2、受体的改变促细胞增殖因子受体的表达增多或异常激恬 (1)某些生长因子受体表达异常增多： 如前列腺癌、乳腺癌、胃肠道肿瘤、卵巢癌中发现有编码表皮生长因子受体(EGFR)的原

25、癌基因erb B的扩增及EGFR的过度表达； 神经胶质细胞瘤中神经生长因子受体(NGFR)明显增多； 人多发性骨髓熘细胞及成人T细胞白血病细胞膜上的IL一2受体及IL 6受体表达异常增高。 脑胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等有血管内皮细胞生长因子(VEGF）受体、FGF受体以及PDGF受体的高表达。 (2)突变使受体组成型激活：如肺癌、乳腺癌、卵巢癌中发现一种缺失N端配体结合区的头部截短的EGFR这种受体处于配体非依赖性的持续激活状态能持续刺激细胞的增殖和转化。 3、细胞内信号转导蛋白的改变在人类肿瘤中发生频率最高的突变是小G蛋白Ras的激活型突变。最常发现的Ras突变是第12位甘氨酸、13位甘氨酸或61位谷氨酰胺为其他氨基酸残基所取代。导致Ras自身GTP酶活性下降。（二)抑制细胞增殖的信号转导过弱转化生长因子对多种肿瘤细胞具有抑制增殖及诱导凋亡的作用，TGF受体是具有丝苏氪酸蛋白激酶活性的受体，受体与配体结合后能磷酸化下游的smad蛋白家族，后者以二聚体的