S2株布氏杆菌减毒活疫苗免疫效果观察

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2、于牛、猪、羊，是引起人类布氏杆菌病的主要 传染源。为此，世界动物卫生组织(ole)将布氏杆菌病列为b类动物疫 病，我国将其列为二类动物疫病，是国际贸易卫生检疫中必检的传染病。20XX年1012月期间，xx规模养殖场先后从天津、唐山、西安 引进奶牛258头，与本地奶牛混群饲养。随着奶牛的大量异地调运， 布病疫情出现快速上升的趋势。20XX年6月至11月，布病感染阳性 奶牛的比例从0.85%上升至U 5.89%,根据检疫结果将布病感染阳性奶 牛强行扑杀，然而通过扑杀的措施并没有取得满意的效果。在混群饲 养的规模养殖场中，处于布病感染潜伏期的奶牛数量较大。至20XX 年2月再次进行检疫时，奶牛群虎红

3、平板凝集阳性率高达30.88%； 试管凝集试验阳性率达到22.99%。从20XX年11月10日20XX年2 月11日，在3个月的时间内感染牛群中44头奶牛发生了流产、死胎 的症状，其中虎红平板凝集阳性奶牛39头，占88.64%；试管凝集阳 性奶牛31头，占70.45%。上述检疫结果证实，该规模养殖场发生了 布氏杆菌野生强毒株的侵袭和蔓延。严峻的布病疫情不仅制约了奶牛 业的可持续发展，而且威胁着牛乳及其乳制品的安全，成为影响民生 的一件大事。我国对家畜布氏杆菌病采取以检疫净化为主的综合防控 措施，同时包括对重点疫区的易感动物接种疫苗，待临床病例逐渐减 少和疫情得到有效控制以后，再实施群体和地域的

4、净化1。为此，对 该规模养殖场实施布病检疫、分群隔离和免疫接种的综合防控方案， 现将奶牛接种s2株布氏杆菌减毒活疫苗的免疫效果报告如下。1材料与方法试剂、疫苗布病虎红平板凝集试验抗原和试管凝集试验抗原 购自青岛易邦生物工程有限公司，在有效期内使用，按 gb/T1864620XX规定的程序操作；s2株布氏杆菌活疫苗购自中牧实业股份有限公司兰州生物药厂， 每瓶含布氏杆菌弱毒活菌4000亿cFu，用生理盐水稀释疫苗，每头 奶牛口服接种500亿活菌剂量，采取投药器喷注到牛舌根及咽喉部免 疫。试验牛根据对奶牛群的布病检疫结果，将布病检疫阴性牛定 为A组，口服免疫503头；布病检疫阳性牛（虎红平板凝集或试

5、管凝 集阳性）定为b组，口服免疫223头。两组奶牛分群隔离饲养，实施 场地环境消毒。疫苗的安全性试验口服接种s2株布氏杆菌减毒活疫苗以后， 观察记录奶牛群的疫苗接种反应。疫苗的免疫效果测定根据奶牛场的生产记录，逐月统计疫苗 接种前后能繁母牛发生流产、死胎症状的病例数，了解口服免疫对布 病感染牛群控制流产率的效果；口服接种活疫苗以后15d、30d、45d、 60d和90d，对A组和b组奶牛群按20%的比例随机抽取血液样本， 定性（虎红平板凝集试验）和定量（试管凝集试验）检测血清中的布氏杆 菌抗体水平，了解活疫苗诱导的抗体消长动态。鲜乳样本布氏杆菌核酸检测10 xpcRbuffer、mgcl2、d

6、nTp、 TaqDnApolymerase、D200DnAmarker等购自大连宝生物工程有限公司。按照中华人民共和国农业行业标准(nY/T146720XX),从鲜乳样本提 取总DnA作为模板，针对布氏杆菌omp25基因合成内外两对引物， 采用嵌合式pcR方法进行扩增，扩增完成以后取5ulpcR产物经1%琼 脂糖凝胶电泳检测。同时以s2株布氏杆菌活疫苗作为阳性对照，灭 菌双蒸馏水作为空白对照，预期扩增片段长度为419bp的DnA带。2 结果疫苗的安全性试验奶牛群接种s2株布氏杆菌减毒活疫苗以后， 无论是布病检疫阴性牛(A组)还是布病检疫阳性牛(b组)，均未观察到 任何接种反应，包括发热、呼吸急

7、促、食欲下降、流产和死胎等症状。 结果表明s2株布氏杆菌减毒活疫苗口服接种是安全的。能繁母牛流产率的控制效果20XX年2月14日该奶牛场口服 接种s2株布氏杆菌减毒活疫苗，疫苗接种前后能繁母牛逐月统计的 流产率见图1。图1.能繁母牛发生流产死胎症状分月统计图 8.00%7.00%6.00%5.00%4.00%3.00%2.00%1.00%0.00%7.34%4.09%3.41 %2.23%2.35%1.65%1.0312月1月2月3月4月5月6月图1.疫苗接 种前后能繁母牛逐月统计的流产率接种疫苗以前3个月，布病感染奶牛场中能繁母牛的月平均流产 率达到4.55%，2月上旬出现流产高峰(7.34

8、%)；接种疫苗以后，能繁 母牛的月平均流产率降低至2.11%，目前控制在1%以下。试验结果 证实，s2株布氏杆菌减毒活疫苗能有效控制布病感染牛发生流产、死胎的症状，减少能繁母牛因流产、死胎导致的经济损失。疫苗诱导的血清抗体水平A组奶牛(免疫前布病检疫阴性)接 种疫苗以后，定期采集血清样本检测疫苗诱导的抗体水平，结果见表1。表1.A组奶牛免疫后布氏杆菌抗体消长动态接种疫苗后平板凝集阳性率抗体效价回1： 100抗体效价=1 ：5015d30d45d60d90d29.7%(30/101)36%(46/100)31.1%(28/29)25%(25/1 00)24.5%(6.9%(7/101)9.0%(

9、9/100)8.9%(8/90)8.0%(8/100)8.0%(11.9%(1 2/101)14%(14/100)5.6%(5/90)8.0%(8/100)8.0%(A 组奶牛接种疫苗以后15d,即可检出疫苗诱导的布氏杆菌抗体，29.7%的免疫牛显现虎红平 板凝集阳性(血清学转换)；30d抗体水平达到高峰(36%)； 4590d抗 体阳性率呈现缓慢下降的趋势(31.1%玲24.5%)。试管凝集定量检测的 抗体效价较低，5.6%14%的血清样本抗体效价为1： 50； 6.9%9.0% 的血清样本抗体效价达到1： 100以上。试管凝集试验测定的抗体消 长动态与虎红平板凝集基本是一致的。监测结果表明

10、，口服s2株布 氏杆菌减毒活疫苗诱导形成的血清抗体水平较低，消失也较缓慢。分群隔离饲养的b组奶牛免疫前布病检疫阳性，接种疫苗以后 15d、30d、45d、60d和90d,虎红平板凝集阳性率分别为95%(38/40)、 92.5%(37/40)、85%(34/40)、92.5%(37/40)和 82.5%(33/40)。 口月艮 s2 株 布氏杆菌减毒活疫苗以后，布病感染阳性牛出现了少数血清抗体转阴 的现象。鲜乳样本布氏杆菌核酸检测结果从接种疫苗的A组奶牛不间断随机采集鲜乳样本90份，按nY/T146720XX规定的程序操作，针 对布氏杆菌omp25基因进行嵌合式pcR扩增。结果见图2。图2.鲜

11、乳样本的嵌合式pcR扩增图15：鲜乳样本；6：灭菌双蒸馏水空白对照；7： s2株布氏杆菌阳性对照；m： D200DnAmarker。s2株布氏杆菌活疫苗阳性对照显现一条419bp的DnA带，灭菌 双蒸馏水空白对照不显现任何条带，4份被检鲜乳样本显现一条 419bp的DnA带，与预期扩增长度相符合。检测结果证实，免疫奶牛 鲜乳样本中能够检出布氏杆菌核酸，检出率为4.44%(4/90)。3讨论根据我国对牲畜布病疫情的监测结果分析，在80年代以前， 布病疫区主要集中在内蒙古、新疆、青海、宁夏和西藏五大牧区；从 90年代以后，牧区布病疫情依然严重，同时半农半牧区和农区省份 的布病疫情明显上升2。20X

12、X年底，该规模养殖场从天津、唐山、 西安大量引进奶牛，与本地牛群混合饲养，导致了布病疫情的流行和蔓延。由于养殖场中奶牛的布病感染率 (22.99%)和患病率(7.34%)较高，处于布病感染潜伏期的奶牛数量较大， 采取检疫一扑杀一补偿的防控方案难以实施，现阶段对布病重点疫区 只能采取疫苗接种为主和检疫扑杀为辅的防控策略。试验结果表明： 无论是布病检疫阴性牛还是布病检疫阳性牛，口服接种s2株布氏杆 菌减毒活疫苗均是安全的；免疫接种能够防止健康阴性奶牛遭受布氏 杆菌的侵袭，有效控制布病感染奶牛发生流产、死胎的症状，减少由 此导致的经济损失。但是，疫苗接种是一种权宜之计，是目前控制重 点疫区布病流行的

13、一种方法。一旦奶牛群接种活疫苗以后，布病感染 的疫情被掩盖了，而不是消失了，因为疫苗接种动物与自然患病动物 无法甄别，法定检疫措施严重受阻。另一方面，布氏杆菌是一种慢性 胞内寄生感染，疫苗活菌在动物体内残存的时间较长，对奶牛群构成 潜在的风险。同时，s2株活疫苗对人体具有一定的毒性，对奶牛场的 饲养员、繁殖员和兽医员形成潜在的威胁。根据内蒙古农牧业科学院 防制布病的经验，采用“s2株菌苗口服免疫为主的综合性防制措施， 一年一次即可控制布病大面积流行，连续3年免疫达到完全控制布病， 通过加强检疫、监测和逐步淘汰，35年内实现奶牛场净化的目标。在布氏杆菌疫苗接种过程中，诱导动物机体主要以细胞免疫

14、为主，以体液免疫为辅。奶牛群口服免疫s2株活疫苗以后，血清抗 体阳性率达到24.5%36%,抗体效价较低。这一监测结果与韩磊等 1描述的血清抗体消长规律比较相似，抗体阳性率的最高值出现在免 疫后1545d（平均30d）,抗体效价达到1： 501： 150；与风英等3 测定的数据存在较大差异泌乳牛和育成牛免疫后20、25、30天的血 清效价都达到1： 400。对布病感染奶牛接种s2株活疫苗以后，风英 等发现“感染牛群布病血清学阳性率没有增加，反而一次降低了 28.3%。本试验也观察到布病感染阳性牛少数（5%17.5%）血清抗体 转阴的现象，阳性牛布病抗体转阴的机理尚待进一步研究。mp25存在于所

15、有布氏杆菌中，是布氏杆菌主要外膜蛋白成 分之一；omp36主要存在于牛流产布氏杆菌(b.abortus)中，是构成跨 膜通道的膜孔蛋白；omp31主要存在于羊马尔它热布氏杆菌 (b.melitensis)中，在绵羊附睾型布氏杆菌(b.ovis)和犬布氏杆菌(b.canis)中表达量也相对较高。按农业行业 标准nY/T146720XX规定的程序操作，针对布氏杆菌omp25基因进 行嵌合式pcR扩增，有利于提高样本中布氏杆菌的检出率，保证布氏 杆菌核酸扩增的属特异性。温富勇等采用布病乳汁环状试验抗原检测 86份免疫奶牛的鲜乳样本，未检出布氏杆菌特异性抗体，因此认为 乳汁是安全的；风英等采用选择性培养基对鲜乳样本进行细菌学检查， 未分离到布氏杆菌，因此认为布病阴性泌乳牛免疫后乳汁无排菌现象; 本试验从布病阴性奶牛免疫后采集的鲜乳样本检出布氏杆菌核酸，检 出率为4.44%。关于疫苗接种奶牛是否存在乳汁排菌的风险，各地学 者持有不同的观点，报告了不同的结果。中国农业大学动物布病防控 研究室吴清明指出，在布鲁氏病流行和防控技术研究对策中，应增加 动物性食品布病病原体的基本检测项目5。近年来随着现代分子生物 学技术的不断发展，国内外学者开始将多聚酶链反应技术(pcR)引用于 布氏杆菌核酸的检测678。在本试验检出的4份阳性鲜乳样本中， 是存在活的布氏杆