胰蛋白酶活力测定

1、实验胰蛋白酶活力测定、原理福林一酚试剂中的磷钨酸和磷钥酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类 化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钥蓝。蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白 酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林一酚试剂反应，生成蓝色 化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正 比。二、实验仪器试管7220分光光度计恒温水浴锅三、实验试剂福林试剂B :见福林（Folin）-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分（冰箱中） 0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至 1000ml10%三氯乙酸溶液0. 2mol/L 磷酸缓冲液（pH7.

2、5）:0.5%酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再 加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并 容至100ml，冷藏在（冰箱）里。500ug/L酪氨酸溶液胰蛋白酶溶液（冰箱中）四、实验步骤标准曲线的制作：按下表加入试剂：管号123456500ug/LB氨酸溶液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20各管中加0.5%酪素2ml，于37对水浴中反应15分钟，然后加入10% 三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml , 再加入福林试剂1ml，于37 C水浴中显色15分钟，测O

3、D680。以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂管号12备注0.5%酪素溶液2.02.037水浴中酶解15分钟0. 2mol/L磷酸缓冲液1.002mg/ml胰酶溶液01.010%三氯乙酸溶液3.03.0过滤上清液1137水浴中显色15分钟0.55mol/L碳酸钠溶液5.05.0福林试剂B11OD6800五、结果计算酶活力：在37对下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。样品中含酶活力单位=A/15 XFA一样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F一酶液稀释倍数原始数据：（注：7号为待测液）液体编度计值0123457液体编度计值

4、012345700.0570.1720.2010.2550.3730.91900.0570.1730.1940.2630.3860.92800.0680.1740.1940.2710.3910.934分光光度计值分光光度计值分光光值度光光分0 -0.05组数酪氨酸浓度为：组数/30 mg/L*系列1值度光光分0 -0.05组数酪氨酸浓度为：组数/30 mg/L*系列1系列2系列3线性（系列3）5 4 5 3 4 3 -O - O o O5 2 5 1 B 2I-1I-O o o o计算得X=12.583换算后得A=6.2915ugF=3故酶活力为1.2583单位六.实验分析误差分析：试管液体的

5、选取：保证选用的胰蛋白酶液是新鲜的，有较好的活性和催化效率尽量保持不同试管溶液配制的时间差达到最小，试管内的溶液不易搁置 太久取液时的操作：各种容器洗后壁上残留水移液管洗刷完后没有润洗，导致所移液体不纯移液管的俯视和仰视使读数不准从水浴中拿出试管，没有使试管完全冷却。是测得的分光值可能不准确， 是液体的温度尽量相等分光光度计的正确使用：分管光度计有锈斑，测量误差较大在使用分光光度计时，一定要先预热，另外，比色皿要选用透明度 好的，有些比色皿由于使用时间过长，或某些原因没有刷干净，颜色发 暗，在某些程度上影响了实验结果，在选取时一定要注意。胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca 2

6、+的存在 下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活 从肽链N端 赖氨酸和异 亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后 转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电 点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300）,其等电点 约为pH10.8，最适pH7.68.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时， 胰蛋白酶易变性，在pH5时易自溶。Ca 2+离子对胰蛋白酶有稳定 作用。重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性, 胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一 些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨 酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还 能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现 为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯 键 酰胺键 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为 底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简 称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸书-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶 活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE ）和对甲苯磺酰-L-精氨 酸甲酯（简称