《林木遗传育种学教学实习》课程大纲

1、林木遗传育种学教学实习课程大纲一、课程概述课程名称（中文）：林木遗传育种学教学实习（英文）：Teaching Practice of Forest Genetics and Forest Tree B课程编号：14483026课程学分：0.6课程总学时：18课程性质：（专业课）二、课程内容简介（300字以内）林木育种学是高等林业院校林学专业教学计划中的一门专业必修课。实践性较强，它以遗传理论为指导进行林木改良和选育及林木的良种繁育，以提高森林生产力，实行集约的林业经营和发挥森林的多种效能。教学实习是本课程的一个重要的教学环节，主要内容包括超级苗选择、树木自然类型调查、优树选择、种子园调查、母树

2、林调查。三、实习目标与要求使学生在实习中根据所学的理论知识，结合林地的生产实际情况，进行林木育种方面的调查研究和实际操作，达到理论应用于实践，提高分析问题和解决问题的能力的最终目的。四、实习内容与安排（一）实习时间：第7 学期 7-8月份。（二）实习方式：林地调查和室内数据整理。 超级苗选择在苗圃中随机取样，测出苗高，依高阶分组统计，确定超级苗标准，进行评选。将入选苗木予以登记。苗期选出具有良好遗传品质的超级苗木是用材树种速生、丰产的基础。 优树选择在当地林场的一、二片合适的选优林分中，根据是人工林或天然林，是同龄林或异龄林之区分，采取不同的优树选择法，根据主要的表型性状：生长量指标、形质指标

3、及抗性指标等，通过实测评选，将符合优树标准要求者登记入选。树木自然类型的调查树木的自然类型是极其丰富多样的，其中的优良类型（群体或个体）是树木育种的宝贵财富。而获得优良类型则是进行树种改良的第一步。可选择林相整齐的中龄树进行类型划分的练习，并对不同类型进行生长量、抗性、材质等方面的比较、分析、研究。 母树林的调查不同树种、不同类型母树林的参观学习，并选择1-2个母树林，进行母树的生长（树高、胸径、冠幅、冠长、生长势）、抗性和结实等状况的调查测定及母树林的营造，经营管理技术的分析研究和效果的评价。 种子园的调查不同树种、不同类型种子园的参观学习。通过访问、座谈，系统了解种子园建立的原则、营建的方

4、法和步骤及管理技术；并可进行不同无性系（或家系）的生长、抗性、结实状况的调查研究，针对存在的问题提出改进措施。（三）实习用具：测围尺、小米尺、树木测高仪、计算器、铅笔、记录本。（四）实习单位或场所：安徽省金寨县马鬃林自然保护区。实习进度与安排：步骤项目具体内容时间分配（天）外业超级苗选择在苗圃中随机取样，测出苗高，依高阶分组统计，确定超级苗标准，进行评选。为造林提供具有良好遗传品质的苗木。0.5优树选择采取不同的优树选择法，根据主要的表型性状，通过实测评选，将符合优树标准要求者登记入选。为种子园的建立提供繁殖材料。0.5树木自然类型的调查选择林相整齐的中龄林进行类型划分的练习，并对不同类型进行

5、生长量、抗性、材质等方面的比较、分析、研究。为进行树种改良而获得优良类型。0.5母树林的调查选择1-2个母树林，进行母树的生长、抗性和结实等状况的调查测定，以及母树林的营造、经营管理技术的分析研究和效果的评价。0.5种子园的调查通过访问、座谈，系统了解种子园建立的原则、营建的方法和步骤及管理技术；并可进行不同无性系（或家系）的生长、抗性、结实状况的调查研究，针对存在的问题提出改进措施。0.5内业数据计算整理整理计算外业调查数据，完成相应表格，并写出实习总结报告。0.5合计时间30五、考核方式与成绩评定 野外工作表现和书面实习报告。执笔人： 曹翠萍2013年12月16日 林木遗传育种学实验课程大

6、纲一、课程概述课程名称（中文）：林木遗传育种学实验（英文）：Experiments of Forest Genetics and Forest Tree Breeding课程编号：14241013课程学分：0.8课程总学时：24课程性质：（专业基础课）前修课程：林木遗传育种学二、课程内容简介（300字以内）本课程既强调理论与实践的结合，也注重对学生进行基本技能的训练、以及实验设计能力和科学研究素质的培养，实验内容包括两个方面：一是验证遗传学与育种学的基本规律，属基础性实验；二是与遗传学与育种学有关的实验技术，又可分为两类：一类是沿用已久，但目前仍有广泛用处的，属综合性实验；另一类内容是近年发展

7、起来的，但在研究工作上很有用处，并涉及有关原理的探讨，属设计性实验。三、实验目标与要求 通过实验巩固和加深对林木遗传学和林木育种学知识和基本理论的理解，并更好地掌握有关的研究技术，培养和锻炼学生用所学知识解决实际问题的能力。四、学时分配林木遗传育种学实验课学时分配序号实验项目名称学时实验类别备注1树木染色体压片法3验证性实验必修2花粉母细胞制片技术3验证性实验必修3树木染色体组型分析3设计性实验必修4树木有性杂交技术4综合性实验必修5PCR扩增技术4综合性实验必修6花粉生命力测定3设计性实验必修7DNA分子标记技术在林木研究中的应用4综合性实验必修合计24注：林木遗传育种学实验课程总计0.8学

8、分、24学时，安排7次实验，其中验证性实验占29%, 综合性、设计性实验占71%。五、教学内容与安排实验一：树木染色体压片法 (验证性实验)（一）实验目的：学习对树木组织、细胞的固定和压片方法，借以观察染色体的动态变化。（二）实验材料与用品材料：杉、松、柏等林木种子用具：显微镜、测微尺、载玻片、盖玻片、酒精灯、恒温水浴、烧杯、滤纸、吸管、绘图纸、铅笔、剪刀等；试剂：卡诺氏固定液、对二氯苯（或8-羟基喹啉）、1N盐酸、铁矾-苏木精染液（或醋酸洋红）等。（三）实验内容与方法1. 取材：种子发芽，根尖长至0.5-1.0 cm时，用水洗净备用。预处理：对二氯苯（或8-羟基喹啉）室温下处理3-5小时。固

9、定：卡诺氏固定液固定根尖2-24小时，可以在70% 酒精中长期保存。水解分离：1N盐酸60恒温水浴下处理6-20分钟，再放在醋酸酒精固定液中进行软化约5分钟。压片：取材-染色-盖片-压片-烤片。镜检：低倍-高倍观察有丝分裂各时期染色体变化的特征。（四）实验结果综述（五）作业 1. 绘制所观察到的有丝分裂各时期图，简述其特征。2. 交一张理想的片子。实验二： 花粉母细胞制片技术 (验证性实验)（一）实验目的：学习树木花粉母细胞的制片技术，了解减数分裂过程。（二）实验材料与用品材料：林木或其他植物材料雄花枝（穗）用具：显微镜、载玻片、眼科镍子、解剖针、酒精灯、量筒、吸水纸等。试剂：洋红、冰醋酸、酒

10、精等。（三）实验内容与方法1. 取材：合适季节采取植物雄花枝，在花粉母细胞开始减数分裂起，连续摘取雄花芽，取整个花序固定，用卡诺氏溶液（3份95% 酒精1份冰醋酸）固定4-12小时。如暂不压片，可以转入70% 酒精中长期保存。压片：取材-染色-盖片-压片-烤片。3. 镜检：低倍-高倍观察减数分裂各时期染色体变化的特征。（四）实验结果综述（五）作业1. 绘制所观察到的减数分裂各时期图，简述其特征。交一张理想的片子。实验三：树木染色体组型分析 （设计性实验）染色体组型或核型（karyotype）是指染色体组在有丝分裂中期的表型，包括染色体数目、大小、形态以及异染色体质的分布特征。组型分析则是对染色

11、体组中的每个染色体进行测量、计算以及形态特征的描述。（一）实验目的 1. 学习和掌握染色体组型分析方法；了解染色体组型分析对植物的进化、物种鉴定和分类等研究的重要意义。（二）实验材料与用品材料: 松类或杉木种子用具：显微镜、测微尺、载玻片、盖玻片、酒精灯、恒温水浴、烧杯、滤纸、吸管、绘图纸、铅笔、剪刀等。试剂：卡诺氏固定液、对二氯苯（或8-羟基喹啉）、1N盐酸、铁矾-苏木精染液（或醋酸洋红）（三）实验内容与方法1染色体有丝分裂片子制作：种子发芽取材、对二氯苯或8-羟基喹啉预处理、卡诺氏固定液固定、1N盐酸水解分离、铁矾-苏木精染液（或醋酸洋红）染色、镜检。（注：以上内容于另一验证性实验内容中已

12、实施，是本实验的先行部分，此略）2显微摄影选取中期染色体分散良好的细胞，进行显微摄影并放大出照片；将其复印并放大成一定倍数。3组型分析 测量与计算：根据放大照片，进行测量与计算；需要测量的项目有：绝对长度：每条染色体测量长度；相对长度：每条染色体的绝对长度与单倍体组的总长度之比；臂比：每条染色体的长臂长度与短臂长度之比；着丝点指数：短臂绝对长度与染色体绝对全长之比；随体和次镒痕：标明有或无。并把测量结果填入下表编号绝对长度相对长度短臂长臂臂比着丝点指数随体次镒痕类型 配对：根据目测和比较染色体的相对长度、臂比、次镒痕的有无和位置，随体的有无、性状和大小，进行同源染色体的剪贴配对。 排列：根据染

13、色体从大到小，按长度顺序编号；等长的染色体，以短臂长的在前，性染色体单独列出。 分类：以臂比数值确定着丝点位置，并据此分类如下：中部着丝点染色体(m)： 臂比1.0-1.7近中着丝点染色体(sm)：臂比1.7-3.0近端着丝点染色体(st)：臂比3.0-7.0端部着丝点染色体(t)： 臂比7.0以上随体长度可以计入或否，但须说明。 绘图：将配对排列好的染色体组型，贴在白卡纸上进行翻拍，并绘制出组型的模式图。（四）实验结果综述（五）作业1. 根据照片进行染色体测量，将数据填入上表。剪下的染色体配对并按顺序排列，并绘制出组型的模式图。用文字简要说明，列出核型公式：2n = 2x = _ m + _

14、 sm + _ st + _ t实验四： 树木有性杂交技术（一）实验目的树木杂交育种，是应用遗传性不同的树种，或同一树种的不同类型，在开花的时候，进行人工控制授粉，以获得杂种的手段，有性杂交，由于基因的重新组合，杂种一代往往出现杂种优势，人工杂交的目的，在于取得和利用杂种优势。通过实验，初步掌握树木有性杂交基本方法，为开展杂交育种打下操作基础。（二）实验材料和用具各种杨树或柳树的雌雄花枝和已达开花年龄的杉木、松树；修枝剪、硫酸纸袋、纱布、棉花、标签、铁牌、回形针、毛笔、授粉器、记载薄、梯子、铅笔等。（三）实验内容与方法1. 切枝杂交技术（又称室内杂交）种子小而成熟期短的某些树种（如杨树、柳树和

15、榆树）可从树上剪下枝条培养，在室内进行杂交。这样，可避免到高大树梢上进行杂交工作的困难，克服花期和产地不一的困难，操作、管理和观察均较方便。现将方法分述如下：(1). 枝条的采取和修剪从已选好的母树树冠的中上部，选12年生无病虫害的，基部直径为1.52.0厘米长70厘米以上的雌花或雄花枝条。采回来的枝条，或从外地寄来的枝条，入室前进行修剪。雄花枝除将生长不良的雄花枝、生长过密的小枝、无花芽的徒长枝和带有病虫害的枝条剪掉外，尽量保留全部花芽，以便收集到大量花粉，雌花每枝留12叶芽，3(2). 水培及管理 将已修理好的枝条，在水中将基部剪成斜面插于盛有清水的大号玻璃广口瓶或瓦罐中，每隔23天换一次

16、水，天热时则应勤换水，并同时洗去枝条基部的分泌物，隔一定时间基部修剪一次。 温室的气温应保持在1518度之间，湿度以70%为宜，并保持室内空气流通，防止病虫害发生。 在每个雌花枝上挂一标签，注明树种名称，采枝时间和花序数目，并按需要的项目进行观察记载。(3). 调节花期为了在雌花开放前准备好必需的花粉，须注意花期的调节，如果雌雄亲本花期相同，则应将雄花枝提前24天放入温室。如果雌雄亲本花期不同，则必须周密考虑，或者更早些培育雄花枝，或者对雌花枝加以低温控制以保证雄花比雌花早开。否则定会使实验失败。(4). 隔离为了达到杂交的预期目的，必须防止自然授粉，应将所有的雌雄花枝在没有开花之前先行隔离。

17、可把同一组合的雌雄花枝放在同一室内，或同一父本的雌花枝放在同一个室内，而不同的组合或不同的父本，则要分别放在不同的室内，必要时也可以在雌花枝上套袋。(5). 去雄授粉榆树是两性花，开花前要去雄。杨树、柳树是单性花，不去雄 当雌花柱头明亮，且有透明汁液时，即可进行授粉，用毛笔沾取花粉轻轻撒在柱头上。如果是以套袋法隔离的，则授粉时，打开袋口进行授粉，之后，再把袋口用回形针别住。 由于同一花序内的各个小花盛开的时期不同，往往是基部的先开，先端的后开，前后可差23天，所以授粉工作应在两三天内连续进行几次，授粉的最适时期是其盛花期每天的811时，因这时柱头上的汁液较多。 授粉后在标签的反面注明父本名称和

18、受粉期。(6) 管理、观察和记载在果实发育期里，温室的温度因受季节的影响将会显著的提高，微生物的繁殖加快，虫卵也开始孵化，所以首先应加强病虫的防治工作，并经常换水和保持室内通风，把温室温度控制在182022度，不可过高。湿度起初也不要低于65%，后期可以低些，但不能低于50%。(7). 收获种子为了避免种子飞散，当果实即将成熟时，套上纸袋。待成熟时，连同袋子一起取下，脱粒，按组合分别保存，并附上标签，注明杂交组合，授粉期和采种期，以备播种。（二）树上杂交1. 去雄和隔离：若是双性花，杂交之前需将选作母本的花去雄，即除去花中的雄蕊。若是单性花只需隔离。去雄要在花粉成熟之前进行。一般用镊子或尖头剪

19、刀直接剔除花中的雄蕊。去雄时要仔细、彻底，不要损伤雌蕊，更不能刺破花药，否则会引起自花授粉。此外，去雄时所用的镊子、剪刀等工具要常浸在酒精中消毒，以杀死沾染上的花粉。去雄要及时套袋隔离，为使雌花有良好的发育条件，隔离袋应选用薄而透明，坚韧的材料。一般风媒花常用半透明的玻璃纸。同时在南方地区为防止雨水浸湿破坏，必须使用蕨根粉糊粘贴，并涂上桐油。虫媒花树木多采用细纱布或细麻布制作隔离袋。隔离袋的大小视树种而异。套袋时袋口最好扎在木质化的老枝上。扎缚处用棉花或废纸裹衬，以免因风吹枝摇而受到机械的损伤，并可防止外来花粉入侵。2. 授粉：待雌花开放，柱头分泌粘液时，即可以授粉。受粉期因树种而异（白腊、栎

20、树为28天，松树45天，冷松、云杉25天，鹅掌楸为半天到一天，杨树为35天。授粉最好在无风的早晨进行，授粉后挂上标牌，注明杂交组合、授粉日期。同时授粉后仍将套袋隔离，当37天后柱头已经萎缩（针叶树苞鳞闭合）时即示失去再授粉的能力，这时可除去隔离袋。但是，如栎类某些树种在幼果发育至成熟时，为防止昆虫危害需再次用纱袋套上。在整个杂交过程要注意细心管理、观察记载，特别注意到杂种种子的采收、处理、保藏等工作。(四) 实验作业按下列各表进行记载：表1切枝杂交母本名称采枝时间枝号No.花芽开放日期授粉树种授粉期授粉花序数采收花粉时期果实成熟期果实数量最初末尾果数种子数表2树上杂交植株数No.套袋隔离去雄日

21、期隔离花果数量授粉日期授粉方式授粉树种取袋日期采果日期果实数量种子数量备注表3切枝杂交和树上杂交工作结束后记载表No.号/号杂交组合授粉花果数量采收果实种子数量杂交成功百分率（%）母父*分母号表示年号，分子表示杂交组合编号实验五：PCR扩增技术 （综合性实验）（一）实验目的1PCR是得到目的基因的重要手段，通过实验，加深理解PCR原理。2掌握PCR扩增仪的编程和使用。（二）实验材料与用品材料：树木叶片DNA仪器：基因扩增仪、电泳仪、紫外照相装置。试剂： DNA模板； 对应目的基因的特异引物； 10PCR缓冲液； 25 mmol/L dNTP混合物：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2

22、.5 mmol/L； Taq酶。（三）实验内容与方法1. 在冰浴中，按以下顺序将各成分加入一无菌0.2 ml或0.5 ml离心管中。 10PCR缓冲液5.0 ldNTP混合物 (2.5 mmol/L)4.0 l引物1 (20 mol/L)1.0 l引物2 (20 mol/L)1.0 lTaq酶 (2 U/l )1.0 lDNA模板 (50 ng/l-1 g/l )1.0 l 加ddH2O至50.0 l2. 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般在9395 预变性3-5 min，进入循环扩增阶段：变性一退火一延伸(如93 变性40 s一58 退火30 s一72 延

23、伸60 s)，循环3. 结束反应，PCR产物放置于4 冰箱，待电泳检测或 -20 4. PCR产物的电泳检测：直接取5-10 l 电泳检测。（四）实验结果综述（五）作业1简述PCR扩增的原理。2影响PCR反应特异性的因素有哪些?4在反应循环结束后为什么还要进行一次72 5如何避免PCR反应中的污染问题?实验六：花粉生命力测定 （设计性实验）（一）实验目的：通过实验，掌握识别花粉形态的一般知识，掌握贮藏花粉及花粉生命力测定的方法及原理；（二）实验材料与用品材料：杉、松、柏等针叶树种用具：解剖针、显微镜、载玻片、盖玻片、滤纸、酒精灯等。试剂：醋酸酐、硫酸、各级酒精、冰醋酸、2，3，5-氯化三苯基四

24、唑盐、次甲基蓝等。（三）实验内容与方法花粉收集、花粉贮藏；醋酸酐分解法或碱处理法制片、花粉形态观察：将需观察的花粉若干放在载玻片中央；加96% 酒精1-2滴洗去花粉外壁油质物；加醋酸酐与硫酸混合液2-3滴（9份醋酸酐1份硫酸）；盖片，酒精灯上徐徐加热，不时观察，待最能显示花粉外壁的形态结构为止，或以花粉粒转变成棕褐色为标准；酒精1-2滴洗涤2-3次；显微镜观察。2，3，5-氯化三苯基四唑盐法、次甲基蓝法等染色法测定花粉生命力：2，3，5-氯化三苯基四唑盐法（利用氧化-还原反应）：配制1%2，3，5-氯化三苯基四唑盐水溶液，调整pH 6.5-7.0，倒入盛有待测花粉的容器内，暗处28-30的温度

25、下2小时以上，取出显微镜下观察；具有生命力的花粉染上红色，无生命力的花粉无色。次甲基蓝法（利用脱氧化酶反应）：花粉置于载玻片上，滴入0.025% 次甲基蓝溶液一滴，盖片，数分钟后镜检；凡无生命力的花粉染成淡蓝色，有生命力的褪为浅蓝色或灰色。（四）实验结果综述（五）作业1. 交花粉制片;2. 描绘主要实验树种的花粉发芽形态图;3. 花粉生命力测定结果统计：每种方法统计三个视野并计算平均值。实验七：DNA分子标记技术在林木研究中的应用 （综合性实验）（一）实验目的1. 学习观察基于DNA分子标记的遗传多样性图谱；2. 了解常用的几种DNA分子标记及其用途。（二）实验材料与用品材料：树木叶片DNA试剂: Taq DNA聚合酶；dNTPs；引物 ；EB (10mg/ml)。仪器：离心机；PCR仪，照相机；稳压稳流定时电泳仪；电子天平。（三）实验内容与方法1DNA提取及检测: 用无菌水把DNA稀释为10 ng/l浓度，贮存于-20 或-702引物设计: 引物设计是ISSR标记技术中最关键、最重要的一步。ISSR引物常为5端或者3端加锚(1-4个碱基)的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列，重复次数常为4-8次。研究实践中所用