实用色谱条件建立方法

1、 第1章绪论1.1HPLC方法建立的步骤有关样品的情况，明确分离目的是否需要特殊的HPLC步骤，样品预处理等选择检测器和检测器设置选择液相色谱法；进行预实验；估计最佳分离条件优化分离条件检查出现的问题或所需的特殊步骤7a.回收纯化的物质7b.定量校正7c.定性方法8.论证方法使之进入常规实验室1.2开始前应知道1.2.1样品的性质有关样品组分和性质的重要信息所含化合物的数目；化合物的化学结构；化合物的分子量；化合物的pKa值；化合物的UV光谱图；化合物在样品中的浓度范围；化合物的溶解度1.2.2分离的目的主要目的是定量分析？一种（不希望有的）物质的检出？未知样品组分的确认？还是纯化物质的分离？

2、其它目的见第13章。是否有必要解析出样品的所有成分？如可能有必要分离出产品中所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此完全分开。当证明仅用一种HPLC方法将样品分开有困难时，将样品组分分离通常会更容易些，如要求定量分析，准确度与精密度需多大？精密度通常达1-2%。该方法应设计多少种不同的样品基质？特殊化合物可能会以不同的样品形式出现（如：原料药，一种或多种形态，环保样品等）。是否需要一种以上的HPLC方法？单一或类似方法分离不同形态样品是否理想？一次将分析多少样品？当一次分析的样品数目超过10个，运行时间一般应控制在20min以内。即将使用该方法的实验室中，有哪些HPLC

3、设备？实验人员操作技能如何？色谱柱能否恒温？HPLC系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行，尤其是在哪些易造成柱外谱峰展宽的老型号仪器上运行？操作者具有什么经历和培训？样品预处理与检测样品来源形式不同，可能以如下形式出现：可直接进样的溶液需稀释，pH缓冲，加入内标或其它定容操作的溶液必须首先溶解或提取处理的固体样品预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱或仪器不受损害HPLC方法建立期间，在第一次进样前，应把握所选检测器能检测到所有的被测样品组分。通常首选可变波长紫外（UV）检测器。1.4建立分离方法1.4.1选择HPLC分离模式与起始条件哪种色谱模式用于该样品最有希望得到理想

4、的结果？本书假设已选定HPLC分离模式，但对具体样品，应在对多种分离模式考察后再做决定。若选定HPLC分离模式，下一步可将样品分为一般样品或特殊样品。一般样品为小分子（小于2000Da）典型混合物，用近乎标准化的起始条件即可分开。否则（或特殊样品时）特殊色谱柱和特定条件才能很好的分离，见表1-2。表1-3总结了适合一般样品首次（反相）分离的实验条件。如样品为中性，一般不需在流动相中加入缓冲液或添加剂，但对于酸或碱性样品，通常需在流动相中加入缓冲剂。碱性或阳离子样品，推荐用“弱碱性”的反相色谱柱，流动相中加入胺添加剂可能对分离有利。首次实验完成后，再按下述讨论系统的加以进一步完善。图1-3利用样

5、品的有关信息，选择初始实验分离条件表1-2特殊样品的处理样品要求无机离子检测为主要问题；实用离子色谱柱异构体有些异构体能用反相HPLC分开，可分为般样品类中；用正相HPLC或环糊精-硅胶色谱柱的反相分离能较好的分离异构体（见第6章）对映体生物样品分离这些化合物需要“手性”条件；见第12章多种因素如分子构象，极性官能团和宽范围的疏水性使这种样大分子品很“特殊”，见第11章“大”分子需要大孔径的色谱柱填料（远大于10nm孔径）；另外，生物分子（第11章）也需这种条件表1-3首次HPLC分离的较好实验条件分离条件较好的首要选择色谱柱尺寸（长度，内径ID）15X0.46cm粒度5pma固定相C或C81

6、8流动相溶剂A和B缓冲液乙腈%B80%-100%b缓冲液（化合物、pH、浓度）25mM磷酸钾，2.0VpHV3.0c添加剂（如胺改性剂、离子对开始时不用d试剂）流速1.5-2.0mL/min温度35-45C样品大小体积e25pL重量e100pga3.5Mm微粒为另一选择（见第5章），用7.5cm色谱柱。b用于初始等度分离；初始用梯度实验较好（见8.2.2节）。c中性样品不需缓冲液；如pH2.5，建议用pH稳定的色谱柱（见5.4.3.5）。d见9.1.1.3。e小体积色谱柱（如7.5x0.46cm,3.5口m）需要的量更小。在图1-3首次实验的基础上，等度或梯度洗脱均可作为合适的方法（见8.2.

7、2节）。这时，也可能明显的看到典型的反相条件不能使样品足够保留说明应用离子对HPLC（见7.4节）或正相HPLC（见第6章第II部分）。当样品以乙月青为流动相时被强保留，可试用非水反相色谱（NARP）或正相HPLC（见6.6-6.8节）。表1-4总结了反相和其他HPLC方法的一些特性。表1-4主要HPLC方法的特性方法/特点/色谱柱何时应该使用该方法?反相HPLC流动相：水-有机溶剂色谱柱：C、C（ODS）、苯基、三818甲基硅烷（TMS）、氧基离子对HPLC流动相：水-有机溶剂，控制pH的缓冲液和离子对试剂色谱柱：C、C（ODS）、氧基818正相HPLC流动相：有机溶剂混合液色谱柱：氰基、二

8、醇基、氨基、硅胶能溶于水-有机混合液的大多数样品尤其中性或非离子化合物的首选离子或可电离的化合物，尤其是碱或阳离子样品的良好选择当反相或离子对HPLC无效时的第二个良好选择；不溶于水-有机混合液的亲脂样品的首选；异构体混合物和制备规模HPLC的首选（最好用硅胶）此处推荐的所有色谱柱（除未键和硅胶）均用键和相微粒装填（见第5章）。本表为典型代表，并不详尽。当分离目的为了分离制备纯样品时，优化的最终HPLC方法将不同于用于才常规定量分析的方法。然而，方法建立开始时对两种情况的操作情况完全一致，如用标准直径（0.4-0.5cmID）的色谱柱和表1-3的其它条件。详见第13章。1.4.2开始方法建立本

9、书除另有说明，都假设样品为一般样品。一般样品与特殊样品方法建立的总策略相似，因此，对分离一般样品的讨论在特殊样品方法建立的许多方面也是可行的。用表1-3的起始条件，首次进样前，唯一需做的选择是流动相中的有机调节剂比例（%B）。选用平均溶剂强度的等度流动相（例如50%B）可能会存在一些问题。推荐先用非常强的流动相（如80%-100%B）,然后按需降低%B。另一种有别于起始等度分离的方法是梯度洗脱，优点比如，可能会确定最好的方法是用等度还是梯度洗脱，估计出下一次实验（等度）的最佳溶剂强度。开始时使用梯度分离对方法建立也有利，与采用强极性溶剂的等度分离相比，梯度分离一般使样品分离得更好。1.4.3改

10、善分离表1-5HPLC方法建立的目标目标评论分离度精密和普适性好的定量分析要求Rs1.5分离时间V5T0min时日常工作较理想定量含量测定：W2%（1SD）；要求不咼的分析：W5%；痕量分析：W15%压力（如果为新柱）V150bar最好，V200bar通常是基本要求峰高溶剂消耗大信噪比的窄峰最好每次运行少用流动相最好基线分离是提供精确结果的有效保障，含5个或更少的样品，使谱峰之间达到基线分离（Rs1.5）般较为容易。分离度会随色谱柱的使用时间逐步降低，也会由于分离条件的微小波动而在不同时间有所变化，因此在建立简单混合物的分离方法时，最好使用Rs$2.0。含有10种或10种以上组分的样品，分离一

11、般会很困难，目标分离度往往必须降低至Rs1.0-1.5。有些HPLC测定不必使全部被测组分达到基线分离，常见于所测样品中可能存在数种化合物单仅需检测其中的一种时。分离所用时间（运行时间最末谱峰的保留时间）应尽量缩短。典型的HPLC步骤所需工作时间2小时左右（即配制流动相、安装与平衡色谱柱、稳定基线、重复注入标准品以确证精密度、可重现的保留值、以及可接受的分离），如果一次仅测定2-3个样品，运行时间在20-30min之间较为合理，但如一次需测定10个或更多的样品，运行时间最好在5-10min之间。使用新色谱柱的工作压力不应超过170bar（2500psi、17MPa）,压力上限最好在2000ps

12、i以下。原因两点：第一，随色谱柱的使用，微粒杂质会逐步堵塞柱头，使柱压成倍升高；第二，较低的压力（V170bar）适于泵、进样阀、尤其是自动进样装置的稳定工作，密封垫的寿命更长，色谱柱堵塞的情况减少，系统的耐久性明显提高。因此，最好以泵的最大允许压力的50%为目标压力。当以表1-3的优选条件开始方法建立时，许多样品仅需调节流动相的强度（B）即可使分离达到要求。其它样品可能需进一步实验工作，包括改变选择性或改善色谱柱条件（柱尺寸、粒度和流速）；见第2章讨论。计算机模拟在第10章作详细的讨论。1.4.4可重现的分离在方法建立过程中改变试验条件（流动相、色谱柱、温度）时，必须经过足够长的时间使色谱柱

13、在新流动相和温度下达到平衡。通常以10-20倍柱体积的新流动相冲洗色谱柱后，色谱柱可达到平衡。然而，应在同一条件下经过重复实验才能得到证明。当前后两次重复实验的保留时间恒定后（0.5%或更好），可认为已经达到柱平衡，实验可以重现。对反相分离来说，当更换的两种流动相中有一种含有的有机调节剂V10%时，则需较长的平衡时间。1.5完善HPLC方法1.5.1定量与方法论证一旦完成了HPLC方法的建立，应对其进行论证，见表1-6和第15章的讨论。在最终论证方法之前，应准备和检查书面分析方案，使之清晰严密实际的论证程序按方法的重要性不同，需时为1天-2周不等。理想的情况是，通过方法论证能找出可能因仪器和操

14、作者的不同而导致的潜在问题。在日常HPLC分析中，柱间重现性可能是主要问题之一。实验不同批号的色谱柱，以证实方法的重现性。任何意外结果都应进行研究，以找出其原因，避免在以后的工作中出现同类错误。最后，不同实验条件对分离的影响应该设定为保证方法普适性的一个组成部分。表1-6完善方法a1应预备数据表明所需方法的性能。2应有为其它操作者使用的书面分析步骤。以一个以上的系统或操作者，用包括期望组分和期望被测物浓度的样品系统的论证方法的性能；比较不同时间和不同实验室之间的实验数据。应得到色谱柱的期望寿命以及柱间重现性的数据。研究不正常的结果，以纠正潜在的问题。6研究所有影响分离的条件（温度、流动相组成、

15、pH等）；规定这些条件的限度；对可能发生的问题（关键谱峰对分离不足；随运行时间延长，最末谱峰保留值增加等）提出建议措施。a主要用于日常工作或质量控制方法表1-6的要求适用于满足精密准确、稳定可靠并可移植转让的严格HPLC标准方法。其他情况下，可能只要求一次成功分离或快速、“粗略”的答复某一特定问题，可免除表1-5、1-6中的许多建议，图1-1中一些步骤也可能不必要。1.5.2解决出现的问题表1-7方法建立和论证期间可能出现的问题问题评论塔板数低色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响（见第5章）色谱柱易变色谱柱选择不对，二次保留的影响（见第5章）性短保留值变化定量精度差色谱柱寿命色谱柱选择不对

16、（见第5章），样品需预处理（见第4章），pHV3或pH7。色谱柱平衡不够（见6-8章），样品需预处理（见第4章），键合相流失（见第5章）需更好的校正，找出误差的来源（见第14章）出现新的干初始分离不够或初始样品无代表性。扰峰其它问题包括：开始时色谱图中有的谱峰可能比所期望的要宽（塔板数低），或谱峰严重拖尾；在方法应用中还会发现用同一（或不同）厂家的“规格”相同的色谱柱替代原柱后，分离情况变得难以接受，常规实验室无法用（规格相同的）另柱重复此方法；色谱柱寿命也可能很短（如进样不足100次即不能再用）；（同一色谱柱）重复进样的色谱图不一样，定量精度较差，保留时间从一系列运行的开始直至结束一直漂移；

17、在后面样品的色谱图中可能出现了其他峰，干扰被测物测定等等。对于将长期使用的常规方法，最好在正式应用之前，对这些问题进行预测并加以改善。1.5.3方法的普适性普适性好的方法指能容忍实验条件的微小变化、一般色谱工作者容易掌握、应用时也不必使用同一HPLC系统的方法，可移交他人使用。在论证期间，方法的普适性可通过深入细致地试验该方法加以确证；也可将其设计成一种程式，研究不同条件对分离的影响。图1-5通过对分离作图，观察不同色谱条件与提高方法普适性的关系这些色谱图明确了受不同条件的影响，需分离的关键谱峰对；同时也明确流动相组成的允许误差。pH值的影响。新色谱柱与原柱保留性质不同，调整条件以改善分离。如

18、不能恒温的HPLC方法的柱温变化；pH值发生小变化精确至0.05或以下。12 第2章分离的基础2.1引言在反相分离中（见6.2节），增加流动相中的有机溶剂比例（%B）会缩短分析时间，但通常也会使谱峰重叠加剧。如果降低流速，则会增加分析时间，但分离效果一般会更好。有时（并非总是）更换色谱柱会改善分离本章的基础知识有助于保证开始方法建立时方向的正确性。并介绍一些重要术语和定义。2.2分离度：总论用相邻谱峰的分离度Rs来衡量组分的分离质量。2（t-t）21Rs（2.1）W+W12式中t与t分别为两相邻谱峰的保留时间，W与W为他们的基线峰宽。图12122-2所示为相邻谱峰分离度Rs=1时的情况。分离度

19、Rs等于两峰中心之间的距离除以平均峰宽。为增加分离度，必须使两相邻峰分离更远，或者减小谱峰的宽度。图2-2两相邻谱峰1与2分离度的计算2.2.1分离度的测定估计或测量分离度的方法有三种：按式2.1计算与标准分离度曲线相比较按两谱峰之间的峰谷计算当谱峰分离良好时，能准确测得保留时间与峰宽，可用式2-1计算分离度。基线宽度W的人工测量包括对每一个谱峰的两条边作切线，测量这些切线与基线交点间的距离(图2-2)。该测量开始有些难以掌握，可能使Rs的测定不精确。另一种方法所得的Rs值较可靠:在半峰高处测定谱峰1和2的峰宽(W)1/2和(W)(W),见附录I中图I-1)。贝U：11/221/21.18(t

20、-t)21Rs二(2.2)(W)+(W)1/211/22当Rs小于1时，用式2.1或2.2计算Rs都可能不准。也可将两个相邻谱峰与标准分离度曲线比较，以测定Rs值。该方法不需计算，方便，并能用于重叠峰(0.4VRsV1.3)。标准分离度曲线的应用见图2-3的说明。两重叠谱峰的“理想”形式可根据谱峰的相对大小和分离度的关系进行计算(假设为高斯峰形；附录I)图2-3中，从左至右的相对峰大小(峰高或峰面积)分别为1/1、4/1、16/1不等。可将实际重叠的谱峰对与图2-3的理想曲线相比较，实际峰与理想峰的匹配应尽可能接近。大谱峰流出的先后无关紧要；只需调换两峰的位置处理即可。图2-3描述分离度及谱峰

21、相对大小（面积）与两谱峰的分离关系的标准分离度曲线一旦达到匹配，图2-3中最接近的响应Rs值即为实际谱峰对应的分离度。详见附录I。第三种估计Rs的方法基于两相临谱峰的峰谷高度，能用于0.82.0或更大应为方法建立的理想目标。明确标出方法建立期间得到的每个色谱图中关键的谱峰对很实用。“关键谱峰对”为Rs值最小的两个谱峰。在方法建立中，系统地改变分离条件，以改善关键峰对的分离，使全部样品足够分开。整个色谱图的分离度通常以分离中的关键峰对的Rs值表示。如果两个谱峰重叠，Rs0.5,该二谱峰在谱图上将如一单峰。如果已知样品中有几种组分，则可避免误认为已完全分开的差错发生；谱峰数应与组分数对应。多数情况

22、下，HPLC分离质量用关键峰分离度和运行时间描述。若所有相关峰的Rs2，运行时间适宜，一般已足够。为改善分离度，需改变某些实验条件（如梯度时间tG），将关键分离度G与改变的条件（tG）作图将很实用。用分离度图能快速估算分离度与分离条G件之间的关系。2.3分离度与分离条件的关系通过改变实验条件，能系统地改变色谱图中任何两谱峰的分离。分离度Rs表示为：kRs=l/4（aT）72（2.3）1+k（选择性）（柱效）（保留值）式中，k为两谱峰的平均保留因子（以前称容量因子，k），N为色谱柱的塔板数，a为分离因子；a=k/k，k和k分别为相临谱峰1和2的k值。2121式2.3将实验参数分为三类：保留值（k

23、）,柱效（N）,选择性（a）。简化了系统改变条件的方案。仅为粗略估算，尤其关于k和a。保留因子k计算：t-tR0k=（2.4）t0式中，t为保留时间，t为色谱柱的死时间。柱死时间与其死体积Vm（色R0谱柱内部的流动相体积)和流速F有关：Vm(2.5)0F当改变条件使k变小(流出快)时，分离度通常下降。使k变大，分离度通常可得到改善。如果增大a，两谱峰分开液加大，因而Rs值提高显著。增加柱效N,谱峰变窄，分离更好，但在色谱图中的相对位置不变。图2-5b说明对于必须提高其分离度的重叠关键峰对来说，哪种办法最好。当两谱峰的保留时间接近tk小，图2-5b(i)，最好的方法是增加k。两0谱峰有部分重叠，

24、且tt图2-5b(ii)，必须增加它们的a或N。不过，R0除非仅需增加少许Rs(30%),通常以努力增加a为好。当两谱峰严重重叠时，tt，图2-5b(iii),一般需增加a。R0图2-5k、a和N对分离度的影响决定k和a的因素包括影响样品保留值或样品在流动相与柱填料之间平衡分配的各种条件：流动相的组成；2.固定相（色谱柱）的特征；3.温度改变流动相或固定相一般会影响k和a，但对N的影响不大。塔板数N主要取决于柱质量，改变柱条件：流速、柱长或载体粒度会影响柱效。但只要流动相与固定相类型不变，改变这些条件就不会对k和a产生太大影响。在方法建立中，最好先改变那些能优化k和a值的条件，然后（可选择的）

25、改变色谱柱条件，则k和a值不变。2.3.1溶剂强度的影响当增加样品保留值k时,分离度增加；如两样品组分靠近t0流出（k0），则Rs0。改变流动相的溶剂强度，能控制样品保留值。强溶剂减小保留，若弱溶剂增加保留。本章中均假设为反相HPLC模式（除另有说明）。表2-1通过改变溶剂强度控制样品的保留值HPLC方法通常如何改变溶剂强度a反相水（A）加有机溶剂（B）（如水-乙腈）；增加%B，k减小正相非极性有机溶剂（A）加极性有机溶剂（B）（如己烷-异丙醇）；增加%B，k减小。离子对与反相的相同。离子交换水缓冲液加盐（如5mM醋酸钠加50mM氯化钠）；增加离子强度（NaCl浓度），k减少。a首先列出流动相

26、组成大多数情况下，中等溶剂强度较好，可使所有组分均在0.5k0.5时，早期流出的杂质峰与被测物峰重叠的可能性也会减小。当k5，入图2-13中的样品4）使峰顶变成平台。sC图2-13进样体积V对峰宽与峰形的影响sV/V=0.3（1）；3（2）；5（3）；15（4）sC只要进样体积V小于小样品峰体积V的0.4倍，峰宽的增加与样品分sC离度的损失将会10%。这一标准（V0.4V）应适用于难分离物质对。例如,sC若采用15X0.46cm的色谱柱,0.5k20。塔板数N=10000,V值将在90-1300CML范围，因此最大进样体积将在35-500PL的范围即V。的最大体积将很大程度取决于被测物（s）的

27、k值。当不限制分离度或样品被溶于比流动相弱的溶剂中时,可以使用大的进样体积。用定量环进样时,样品在进入色谱柱之前（由于层流）已与流动相混合,因此样品进入色谱柱时体积一般增加（约50%）；即样品体积对峰展宽的影响比式2.16预测的要大。表2-4基于式2.16总结了样品体积对峰宽的影响。样品体积给峰宽的影响对宽峰（大V）不很重要，因为所用的样品体C积V、比值V/V很小，这说明色谱图中谱峰流出越早（峰较窄）受大体积ssC进样的影响越大，类似于其它柱外峰展宽效应的影响（见2.3.3.3节）。表2-4进样体积（定量环进样）对峰宽与峰高的影响V/VasCVb相对峰高0.05(1.00)0.11.010.1

28、00.21.030.190.31.060.280.41.100.360.61.220.491.01.530.651.52.000.752.02.520.795.05.860.8510.011.60.86（最大）V为样品体积；V为小体积样品的基线峰体积。sCV为观测的峰体积样品是用非流动相溶剂溶解的溶液时，如果样品溶剂比流动相弱，可适当加大进样体积，对峰宽与分离无不良影响。相反，如样品溶剂比流动相强，大进样量往往会导致峰展宽和/或色谱图中早流出峰的变形，应尽可能加以避免。如果改变样品溶剂不方便，有时可减小溶于强溶剂（如100%B）中的样品量。若先用弱的A溶剂稀释样品（如方向HPLC中，用水），然后再适当加大样品的进样量，也可有效的减少样品溶剂引起的问题。见5.4.2节讨论。2.4.2质量超载：样品重量对分离的影响因色谱柱对保留样品有一容量限度（即固定相被样品所饱和），进样体积小，样品质量也可能会使柱超载。色谱柱吸收的化合物量X可用兰格缪尔（Langmuir）等温线估算，其说明见图2T4a中以固定相吸收的X对流动相中的X浓度（平衡时）所作的对数曲线图。X在流动相中的浓度X很小时，（如图2-14a中的X3）,色谱柱吸收的X与流动相中的X浓度呈正比（线性等温行为）。在线性等温条件