褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过度磷酸化的影响及机制

1、褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过度磷酸化的影响及机制【关键词】阿尔茨海默病摘要：目的讨论褪黑素(el)对花萼海绵诱癌素(A)在成神经瘤细胞诱导的神经细丝过度磷酸化中的影响及其机制。方法采用鼠野生型成神经瘤细胞(N2at)，给予A处理，或同时给予不同浓度el或维生素E(VitE)处理，并用免疫印迹法检测神经细丝磷酸化程度和蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)含量，32P特异底物标记技术检测PP2A活性。结果A可在N2at细胞引起神经细丝过度磷酸化，同时伴有PP2A含量和活性降低。el对A引起的神经细丝过度磷酸化有保护作用，且强于VitE；el同时对抗A诱导的PP2A活性和含量降低。结论el可通过调

2、节细胞内PP2A的含量和活性而减轻A引起的神经细丝过度磷酸化。关键词：阿尔茨海默病；花萼海绵诱癌素；褪黑素；神经细丝；过度磷酸化ABSTRAT:bjetiveTinvestigatetheinviveffetfelatninnalyulinAinduedneurfilaent(NF)hyperphsphrylatininneurblastaells(N2at).ethdsN2atellseretreatedithArAanddifferentnentratinelatninrAandvitainE,thelevelsfneurfilaentphsphrylatinandthelevelfPP2

3、Aeredeteted,andtheativitiesfPP2Aereassayed.ResultsalyulinAtreatentledtneurfilaenthyperphsphrylatinbydereasingthelevelandativityfPP2A.BthelatninandvitainEhadprtetiveeffetnalyulinAinduedneurfilaenthyperphsphrylatin,althughelatnininreasedtheativityfPP2AhilevitainEdidnt.rever,elatninpartiallyattenuatedt

4、hedereasingfPP2Alevel.nlusinelatninprtetsneurblastaellsfrAinduedneurfilaenthyperphsphrylatinthrughtheregulatinfPP2AlevelandtheinreasefPP2Aativity.KEYRDS:AlzhEiersdisease;alyulinA;elatnin;neurfilaent;hyperphsphrylatin阿尔茨海默病(Alzheiersdisease,AD)是一种以进展性记忆减退和认知功能障碍为主要临床病症的神经退行性疾病，神经原纤维缠结(neurfibrillaryt

5、angles,NFTs)是其主要病理特征之一。NFTs主要由异常过度磷酸化的tau蛋白构成，tau蛋白作为细胞内的主要骨架蛋白，对微管组装、维持微管稳定性都具有重要作用。神经细丝(neurfilaent，NF)是骨架蛋白中的中间丝，由低(NFL)、中(NF)、高(NFH)分子量的三种亚基组成，它与微管、微管相关蛋白(包括tau蛋白在内)等其他骨架蛋白存在广泛的互相作用，并共同维持着细胞骨架的正常构造。Nany等证实异常过度磷酸化的神经细丝也是NFTs的重要组成成分，因此其在AD发病机制中的作用也日益受到重视。褪黑素(elatnin，el)是由松果体分泌的一种具有多种生物学功能的内分泌激素，随着

6、年龄的增长其分泌量逐渐下降。研究发现AD患者脑脊液中el的程度显著低于同年龄正常人群，临床上AD患者给予el后，可以改善某些患者的认知功能。因此，el分泌紊乱在AD的发病过程中可能起重要作用。最近有人报道，el可阻断或逆转冈田酸(kadaiaid,A)在神经瘤细胞(N1E115)引起的氧化应激、细胞凋亡和微管破坏。我们曾报道el可对抗花萼海绵诱癌素(alyulinA,A)在SY5Y细胞引起的神经细丝过度磷酸化。为进一步研究el对抗A引起的神经细丝过度磷酸化的机制，我们分别用el和维生素E(vitainE,VitE)与A同时处理成神经瘤细胞N2at，用免疫印迹法检测神经细丝磷酸化程度和PP2A含

7、量，免疫标记技术检测PP2A活性。结果发现el和VitE可对抗A引起的神经细丝过度磷酸化，同时el对抗A引起的PP2A活性降低和含量降低。本实验进一步提醒了el和VitE对抗A诱导的神经细丝磷酸化的机制。1材料与方法1.1主要试剂DE、ptiE、胎牛血清(FBS)购自美国Gibi公司；丙烯酰胺(Ar)、N，N亚甲叉双丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸(Glyine)、小牛血清白蛋白(BSA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、el、VitE均为美国Siga公司产品；过硫酸铵(AP)、二喹啉甲酸(BA)蛋白检测试剂盒购自美国Piere公司；硝酸纤维素膜(N

8、膜)为Hybnd公司产品；单克隆抗体SI31(识别磷酸化的NFH、NF，15000)、SI32(识别非磷酸化的NFH、NF，15000)、R123d(识别PP2A的催化亚单位，11500)购自Sternberger公司，所用抗体稀释液为50g/L脱脂奶粉，TBS/T配制；辣根过氧化物酶标记的二抗和EL显色系统购自Santaruz公司；A购自美国Biheial公司；32PATP购自北京亚辉生物医药公司。1.2细胞培养鼠野生型成神经瘤细胞贴壁生长细胞株(N2at)由许华熙教授(TheBurnhaInstitute,LaJlla,alifrnia,USA)提供，细胞用含50g/L胎牛血清(FBS)的

9、DE/ptiE(11)培养基，在5%(体积分数)2、37培养箱内进展培养，每2-3d更换培养液一次，细胞达约70%-80%丰度时，传代或用于实验。给药处理前，细胞用无血清培养基培养12h诱导分化。细胞分为6组：正常对照组，参加含DS(0.01%体积分数)的培养基；A组，参加5nl/LA；25l/Lel组，参加5nl/LA同时参加25l/Lel；50l/Lel组，参加5nl/LA同时参加50l/Lel；100l/Lel组，参加5nl/LA同时参加100l/Lel；VitE组，参加5nl/LA同时参加50l/LVitE。1.3蛋白质印迹分析按上述分组加药处理细胞12h后，弃培养基，预冷的PBS洗2

10、次，参加细胞裂解液90L(50l/LTrislpH8.0，150l/LNal,10L/LTritn，1g/LSDS，0.2g/LNaN3，100g/LPSF，1g/Laprtinin，PSF和aprtinin临用前参加)，在冰上静置10in，用细胞刮刮起细胞并转移到EP管中，参加4加样缓冲液30L，煮沸10in，超声破碎(35s)，12000g离心10in，取上清。取样品参加各个泳道(保证各泳道参加的样品蛋白总量为10g)，蛋白质经7.5%SDSPAGE凝胶电泳别离后被转移至N膜上；N膜用50g/L脱脂牛奶室温封闭1h，分别参加单克隆抗体SI31、SI32，R123d，4孵育过夜，然后用含1g

11、/LTeen20的TBS(TTBS)漂洗(35in)；再参加适当稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37孵育1h，TTBS漂洗(35in)；参加EL显色液，显色1in，终止显色并将胶片置于N膜上，在暗室里曝光30s，免疫印迹结果扫描后用图象分析系统分析。1.4PP2A活性测定按照Gng等的方法。在磷酸化缓冲液(单位：l/L，TrisHl40、pH8.5,E20，al20.2，gl215)中，磷酸化酶b(Phb，2g/L)和0.5l/L32PATP及10g/L磷酸化酶激酶(PhK)，在30孵育10in后，Phb被磷酸化为Pha并有一局部被32P标记；32P标记的磷酸化酶a(32PPha)经Sepha

12、dexG50柱与游离ATP(Free32P)别离，搜集组分中32PPha的放射性/(Free32P的放射性+32PPha的放射性)100%95%作为PP2A的底物。PP2A催化32PPha释放出32P，根据32P的释放量可断定PP2A的活性。反响体系总体积20L，含Tris50l/L、pH7.0，BE10l/L，EDTA0.1l/L，affeine7.5l/L，7.5g/L32PPha和0.06g/L细胞提取物及0.2g/L抑制因子1(PP1的特异性抑制剂)，反响以参加32PPha开场，30进展30in，参加10L终止液(4l/LATP、200g/L三氯乙酸溶解)终止反响，取7L反响混合物点到

13、层析纸上，释放出的32P在50g/L三氯乙酸(0.2l/LNal溶解)层析液中通过上行色谱法与底物别离。然后用erenkv液闪仪进展闪烁计数分析。1.5统计学处理实验数据以s表示，采用SPSS10.0统计分析软件行方差分析，以P0.05为差异有显著性。2结果2.1el和VitE对A诱导的神经细丝磷酸化的影响本研究用识别磷酸化的神经细丝(NFH，NF)的抗体SI31和识别非磷酸化的神经细丝(NFH，NF)的抗体检测神经细丝的磷酸化状态。神经细丝的免疫印迹结果显示：A处理后SI31显色显著增强(图1A)，而SI32显色显著减弱(图1B)；25、50、100l/Lel和VitE使SI31显色减弱(图

14、1A)，SI32显色增强(图1B)。图象分析结果进一步显示：el在50l/L时对神经细丝的磷酸化的保护作用最强，且比同浓度的VitE的作用更强。结果提示A处理12h后N2at细胞的神经细丝发生了磷酸化，el和VitE对A诱导的神经细丝的磷酸化有保护作用。图1el和VitE对A诱导的神经细丝磷酸化的影响略2.2el和VitE对A引起的PP2A活性变化的影响我们以前报道了el对A和A引起的神经细丝的过度磷酸化都有保护作用4,7，因此我们推测el对骨架蛋白磷酸化的保护作用可能与其升高PP2A活性有关。为了进一步讨论el对A引起的神经细丝过度磷酸化的保护机制，我们用32P特异底物标记技术检测PP2A活

15、性。结果显示：A组细胞内PP2A活性与正常对照组相比显著降低(P0.01)；25、50、100l/Lel处理组的PP2A活性与A组相比均显著升高(P0.01)，但随el浓度升高，PP2A活性升高程度降低；VitE组的PP2A活性与A组相比显著降低(P0.01)。结果提示低、中、高浓度el对A诱导的PP2A活性降低均有保护作用，而VitE对之无保护作用(图2)。图2el和VitE对A诱导的PP2A活性降低的影响略2.3el和VitE对A引起的细胞内PP2A含量的影响为进一步讨论el对抗A引起的PP2A活性降低的机制。我们用识别PP2A的单克隆抗体R123d检测细胞内PP2A含量。结果发现：A组的

16、R123d显色较正常对照组减弱(P0.01)；25l/Lel组和50l/Lel组的R123d显色强于A组(P0.01)；100l/Lel组和VitE组的R123d显色与A组相比无统计学差异(P0.05)。结果说明A显著降低细胞内PP2A程度，25、50l/Lel可局部对抗A引起的细胞内PP2A程度降低(图3)。图3el和VitE对A诱导的PP2A含量降低的影响略3讨论我国学者曾报道AD患者脑和脑脊液中磷酸化的NFH和NF程度显著升高，PP2A和PP1的特异性抑制剂A处理人神经瘤细胞SY5Y后，细胞出现了相似的结果。最近，我们发现PP2A和PP1的另一种抑制剂A处理SY5Y细胞也可引起神经细丝过

17、度磷酸化。在本实验中，我们发现A处理N2at细胞后，细胞内神经细丝发生过度磷酸化，PP2A含量显著降低，但PP2A活性轻度降低。我们曾报道A处理后，细胞内出现明显的氧化应激和脂质过氧化，同时细胞内GSK3活性显著升高。根据报道，脂质过氧化产物可激活GSK3引起tau蛋白过度磷酸化，我们认为A引起神经细丝过度磷酸化的机理不仅与其降低PP2A含量和PP2A活性有关，而且还与其促进氧化应激有关。el既具有脂溶性，也具有水溶性，容易通过血脑屏障进入神经细胞。研究说明，el可逆转或阻断A引起的氧化应激、细胞凋亡、骨架蛋白破坏。在本实验中，我们发现低、中、高浓度el均可局部对抗A引起的神经细丝过度磷酸化，

18、但高浓度el的对抗作用比低、中浓度的作用弱；同时，el还可升高PP2A活性，但随el浓度升高，其升高PP2A活性的作用减弱；VitE虽降低PP2A活性，但也可局部对抗A诱导的神经细丝过度磷酸化。我们推测其可能原因为：VitE局部对抗A引起的氧化应激和脂质过氧化，从而对抗A引起的GSK3活性升高；同时VitE降低PP2A活性，又使Ser9磷酸化的GSK3去磷酸化减少，从而Ser9磷酸化的GSK3占总GSK3的比例升高，GSK3活性低于正常，进而恢复GSK3/PP2A平衡，对抗A引起的神经细丝过度磷酸化。详细机制尚需进一步实验证明。总之，本研究证明el对A所致的神经细丝过度磷酸化有保护作用，其机制

19、可能与el对抗A诱导的PP2A含量及活性降低有关。参考文献：1SternbergerNH,SternbergerLA,UlrihJ.AberrantneurfilaentphsphrylatininAlzhEierdisease.PrNatlAadSiUSA,1985,82(12):42744276.2LiuRY,ZhuJN,VanHeerikhuizeJ,etal.Dereasedelatninlevelsinpstrteerebrspinalfluidinrelatintaging,Alzheiersdisease,andaplipprteinEepsiln4/4gentype.JlinE

20、ndrinletab,1999,84(1):323327.3henansfieldJ,GarfinkelD,LipsnS.elatninfrtreatentfsundninginelderlypersnsithdeentiapreliinarystudy.ArhGerntlGeriatr,2000,31(1):6576.4BenitezKingG,TunezI,BellnA,etal.elatninpreventsytskeletalalteratinsandxidativestressinduedbykadaiaidinN1E115ells.ExpNeurl,2022,182(1):151159.5LiSP,D