遗传学第五章 基因组课件

1、第五章 基 因 组本章重点:基因定位序列作图基因克隆基因组：单倍体细胞中所含的整套染色体。 基因组：单倍体细胞中所含的整套染色体所包含的DNA分子以及DNA分子所携带的全部遗传指令。人类基因组：22条常染色体和X、Y染色体的DNA组成。 基因组 生物体单倍体DNA总量称为 C值。 C值最大最小相差10万倍。 C值同生物进化是什么关系？一、C值悖论和序列复杂性1、 C值悖理（C-value paradox）第一节 基因组DNA序列组成基因组大小 种 类 Mb大肠杆菌 4.64啤酒酵母 12.1线 虫 100.0果 蝇 140.0蝗 虫 5000.0小 鼠 3300.0豌 豆 4800.0玉 米

2、5000.0小 麦 17000.0 人 3000.0 霉菌藻类G+细菌G-细菌显花植物鸟类哺乳类爬行类两栖类硬骨鱼类软骨鱼类赖皮类甲壳类昆虫类软体动物蠕虫类真菌枝原体A 生物体进化程度高低 与大C值不成明显正相关 B 亲缘关系相近的生 物大C值相差较大C 同一类生物内大C值 与小c值相差极大 （Euk. 人体 c = C/10） ( Prok. x174 c C ) 2、序列复杂性在同一类生物中，不同种的基因组大小悬殊差别。主要差别在于“多余”（excess）DNA的量的差别。 “多余”DNA量多，则基因组大；“多余”DNA量少，则基因组小。“多余”DNA主要是重复序列。序列复杂性:不同序列的

3、总长度称为序列复杂性,用bp表示。 140bp: (1)20bp,30bp,40bp,50bp 20+30+40+50=140bp (2) 70bp(2个拷贝) 70=70bp序列复杂性高低反映了序列包含的遗传信息量的大小。生物体基因组的复杂程度还表现在基因的外显子数目的多寡。二、基因组DNA序列的分类1、编码序列和非编码序 编码序列：编码RNA和蛋白质的DNA序列。 非编码序：内含子和基因的间隔序列。2、单一序列和重复序列 单一序列： 基因组中只有一份的DNA序列。 重复序列：基因组中重复出现的序列。如STR,微卫星DNA等三、DNA复性动力学 D.S. DNAS.S. DNA ( 加温,

4、极端pH ) Renaturation 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA ) 影响复性的因素：真核生物：第1组分（25%），快，高度重复序列；第2组分（30%），中，中度重复序列；第3组分（45%），慢，单一或少拷贝； 温度 时间 离子强度 DNA片段大小 DNA序列复杂性 DNA分子浓度四、重复序列家族重复序列家族:是指一类核苷酸序列高度相似的重复序列，这些重复序列包括基因和基因以外的序列。基因家族:真核生物基因组中来源相同，结构相似、功能相关的一组基因可归为一个基因家族。基因家族可归

5、入重复序列家族，但不是其主要组成，主要组成基因以外的序列。基因组学结构基因组学功能基因组学基因和基因组的结构各种元件的序列特征基因作图和基因定位不同序列结构具有不同功能基因表达的调控基因与环境相互作用转录物组学蛋白质组学表型组学第二节 基因组研究一、人类基因组研究1986 美 Dulbecco首次提出了“ 人类基因组工程”1990.4月美国宣布人类基因组测序工作的5 年计划。2001.1.12 中、美、日、德、法、英等国科学家（Nature,15日) 和美国塞莱拉公司(Science,16日) 各自公布人类基因组图谱和初步分析结果。约3万基因。我国参与研究的第3号染色体，共计3000万个碱基对

6、，约占人类基因组全部序列1%（1999.9月加入这一研究计划）。人类基因组计划（HGP）遗传图物理图序列图基因图基因定位 基因克隆 基因转移 比较基因组研究物种的起源与进化基因的证实与克隆生物学的发展 水稻等作物基因组计划猪，牛等家畜基因组计划二、基因定位和作图1、基因标记和作图界标基因标记：利用可鉴别的形态、生化等表型性状作标记。如：血型、蛋白质氨基酸、等位基因等图谱标记：可用基因或DNA作为可鉴别的标记(marker)。基因标记和DNA的分子标记。分子标记：特定DNA序列构建遗传图谱的标记。 每种生物DNA具有稳定性。 （1）RFLP restrict fragment length po

7、lymorphism 限制性片段长度多态性 （2）SSLP simple sequence length polymorphism 简单序列长度多态性 （3）SNP single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性 （4）STS/EST 非多态的短单一序列作为标界DNA的分子标记RAPD random amplified polymorphism DNA 随机扩增多态性AFLP amplified fragment length polymorphism 扩增片段长度多态性如一对同源染色体二个DNA分子，一个具有某种酶的酶切位点，另一个无此位点酶切后形成的DNA片段

8、长度就会有差异，即多态性(RFLP) 根据该等位基因的遗传，将RFLP作为标记定位在基因组的某一位置上。限制性内切酶多态性:限制性内切酶能识别和切割特异核苷酸序列，DNA序列能或不能被某一酶酶切，实际上相当于一对等位基因的差异。（1） RFLP 限制性片段长度多态性（2） 简单序列长度多态性(simple sequence length polymor-phisms,SSLP) 简单序列长度多态性,又称为VNTR variable number tandem repeat 数目可变的串联重复多态性。指重复单位相对较小,由重复单位的序列差异和数目变化,可形成丰富的多态性。 包括:小卫星序列、微卫

9、星序列 。小卫星序列(microsatellite) :又称简单重复序列(STRs) ，常只有24个核苷酸重复单位。 微卫星(minisatellite)也称多次重复序列(VNTR)，重复序列长度为几十个核苷酸。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，据串联重复排列微卫星基序两侧的单一序列可以人工合成引物,对微卫星序列（microsatellite DNA或simple sequence repeats，SSR）进行扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来,由微卫星基序重复数目的变异而产生多态性。随机扩增片段长度多态性DNA，简称RAPD技术，是由Williams和Wel

10、sh（1990）同时发展起来的一项新的遗传标记技术。RAPD以PCR为基础而又不同于经典的PCR，一般采用10个核苷酸的DNA 序列为引物，扩增时退火温度降至35左右。与其他标记相比,RAPD具有以下优点：不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一套引物可用于不同生物的分析。操作简单，可实现自动化，短期内可利用大量引物完成覆盖的分析。不需制备探针、杂交等程序，成本较低。DNA用量少（10ngDNA即可完成一次分析）,允许快速、简单地分离DNA。已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用。RAPD是一种显性标记,分离群体中纯合体和杂合体通过后代才能区别，并且由于该技术采用的

11、是随机引物扩增，扩增结果的稳定性较差，这在一定程度上限制了其发展。（3）随机扩增片段长度多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD ）DNA指纹图谱主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。 SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但

12、通常所说的SNP并不包括后两种情况。 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）氯吡格雷(抗凝药) 中断杂交实验(min) ： F + F HfrF （2）细菌的基因定位（3）人类家系分析定位 Y染色体X染色体常染色体： （4）原位杂交定位DNA或RNA分子探针 放射性标记 分子杂交显影/显色 基因定位（1）酶切 完全酶切 部分酶切3、序列图作图（1）酶切（2）叠连群建立（3）序列测定（2）叠连群建立（3）序列测定DNA测定的酶法，化学测序法 DNA自动测序DNA测定的酶法：即Sanger法、终止法、双脱氧法 DNA聚合酶， 单链DNA模板，引物复性

13、后分4份 加4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和 dCTP） ，其中一种为-32P标记 各加一种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）,3 缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成 磷酸二酯键。 经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离制得的放射性自显影区带图谱 直接读得DNA的碱基序列序列测定方法之一AGTTGCTA化学测序法又称Maxam-Gilbert法序列测定方法之二把待测序的DNA分子成单链分子，其5端用32P进行放射性标记。分成4份，每份用一种化学试剂处理DNA片段，每种试剂可使DNA分子在一种碱基的5端的磷酸二酯键处发生断裂。使每个DNA分子只发生一次断裂。把这4种反应产物用聚丙烯凝胶电泳

14、进行分离，用X光胶片进行曝光，得到一张由不同条带组成的序列图。从图上就可以读出待测DNA片段的碱基序列。序列测定方法之三DNA自动测序仪： 根据Sanger法酶促原理 4种荧光染料标记引物 激光照射 阅读4种颜色GACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCA

15、ACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAA1.部分酶切3.叠连群建立2.DNA测序CTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAA

16、ATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCACTGGACCAGCACTGGACCAGCACTGGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAAT

17、CAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGC

18、AGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTG

19、GACCAGCAGTTAGAAATCA克隆:是英文Clone一词的单译，意为无性繁殖系，即通过无性繁殖（如细胞丝分裂） 可连续传代并形成的群体，常用于细胞水平的描述。克隆技术（Cloning）:则指由众多 的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或细胞的技术操作。 基因克隆:是指某种目的基因的分离过程，通常是将生物材料的遗传物质如DNA以酶切成片断， 插入到载体中，通过无性繁殖（细菌或细胞的倍增）使其扩增，然后再以某种探针选 择、钓取目的基因。2、基因克隆（Clone）基因克隆策略： 1）功能克隆： 2）定位克隆； 1）功能克隆克隆（致病）基因的一种策略。收集所要克隆的基因的蛋白质产物

20、及其功能的信息，用以分离基因，并对基因进行定位。性状（疾病）蛋白质产物（生物学功能）从氨基酸序列出发设计DNA引物，从文库调取基因得到基因序列染色体定位疾病功能基因血红蛋白病镰刀形细胞贫血症正常HbA四条多肽链（2条链，两条链） 2）定位克隆又称为“逆向遗传学”，始于20世纪80年代后期利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。疾病遗传标记，染色体定位基因序列mRNAcDNA蛋白质产物生物学功能 疾病 基因功能贺林实验室利用布依族、苗族和汉族的三

21、个A-1型短指（趾）症大家系，对该病的致病基因进行了精确定位（位点定在2q35-36区）、克隆，并首次发现了人IHH基因和该基因上的三个突变位点是导致A-1型短指（趾）症的直接原因。A-1型短指（趾）症位点定在2q35-36区1）构建基因文库：用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。cDNA文库基因克隆具体方法：2）筛选文库：用放射性同位素或非放射

22、性化学物质标记探针（待克隆的基因或cDNA的一段同源序列）同文库的细菌克隆或噬菌斑作核酸分子杂交经放射自显影或显色反应后，可以筛选出含有同探针互补序列的细菌克隆或噬菌斑然后分析这些重组载体中所插入的DNA片段或cDNA最后分离出所要的基因或cDNA。 3）染色体步移知道距该基因一定距离上的一段DNA序列用该DNA序列作探针,筛查文库,得到阳性克隆分离出来重组载体中的插入片段用这个片段的末端部分作探针再一轮筛查文库得到新的重组载体中的插入片段再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因4）电子杂交EST express

23、ed sequence tag,EST 表达序列标签，短的、单次（测序）阅读的cDNA序列。 EST1 200-300bp的cDNA片段 用EST1搜索EST数据库 得到含一段共同序列另一个新EST2 EST1、 EST2拼接延伸成为EST3 用EST3搜索EST数据库 得到EST4 EST3、 EST4拼接延伸EST5 用EST5搜索EST数据库 全长cDNA序列。 全cDNA序列探针， cDNA文库筛查，PCR扩增 全cDNA基因四、基因组功能研究基因时空专一表达：只在特定时间、特定空间（组织）的表达。PCR3 AATTTTTTTTTTTpoly(T) 55-CUUUGATGAAAAAAAAA-poly(A) 33 TTTTTTTTTTTpoly(T) 53 ACTTTTTTTTTTTpoly(T) 53 GATTTTTTTTTTTpoly(T) 53