尹礼国第5章 酶学1021课件

1、第五章 酶学Enzyme酶（enzyme）是一类由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质。 enzyme是希腊文 en = in ， zyme = yeast酶学研究简史公元前两千多年，我国已有酿酒记载。一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。1878年，Khne首次提出Enzyme一词。1897年，德国 Buchner兄弟用不含细胞的酵母液实现了酒的发酵。1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶 (deoxyribozyme)，并证明酶的化学本质是蛋白质。1982年，Tom Cech（美）发现四膜虫的rRNA前体加工中，RNA具有自身催化作用

2、。我国古代人民利用酶的历史人们对酶的认识起源于生产与生活实践。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。醋酱酶及生物催化剂概念的发展克隆酶、遗传修饰酶蛋白质工程新酶生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类： Enzyme (天然酶、生物工程酶)核酸类：Ribozyme ; Deoxyribozyme模拟生物催化剂一、酶的催化特性 1. 提高反应速度，不改变平衡点; 2. 只起催化作用，本身不消耗； 3. 降低反应的活化能。 与一般催化剂相同的特点 活化能(activation energy) 指在一定温度下，1m

3、ol底物全部进入活化态所需要的自由能 单位：KJ/mol酶催化反应的实质：降低反应的活化能2. 高效性且无副反应反应速度是无酶催化/普通人造催化剂催化反应速度的1061016倍。3.专一性Specificity: 酶对催化的反应和反应物有 严格的选择性。底物（Substrate): 酶作用的物质。 （1）酶浓度的可调性 （2）通过激素调节酶活性 （3）反馈抑制调节酶活性 （4）抑制剂和激活剂 （5）别构调控、共价修饰、同工酶等 4. 可调节性三、酶的命名和分类（一）习惯命名法根据其催化底物来命名,如淀粉酶、蛋白酶等；根据所催化反应的性质来命名,如脱氢酶、转移酶等；结合上述两个原则来命名，例如丙

4、酮酸脱羧酶等。有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。优点 命名简单应用历史较长，使用方便缺点一名数酶、一酶数名为了适应酶学发展的新情况，国际酶学会议于1961年提出一个新的系统命名法及分类原则，已被国际生化协会采用。 底物1 ：底物2 + 反应性质+酶 乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：NAD+氧化还原酶水解反应中当底物为水时，可省略 系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：NAD+氧化还原酶 惯用名：只取较重要的底物名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。

5、四、国际系统分类编号 1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：氧化-还原酶催化氧化-还原反应，催化氢的转移或电子传递。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。1、氧化还原酶 OxidoreductasesAH2 + B（O2）A + BH2（H2O2，H2O）六大类酶的特征（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应AH2 +BA +BH2（需辅酶或辅酶）（2）氧化酶类催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2 + O2A + H2O2（需FA

6、D或FMN）催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2 + O22A + 2H2O（3）过氧化物酶ROO + H2O2RO + H2O + O2转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。根据X分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。2、转移酶 TransferaseAX + BA +BX水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：3、水解酶 hydrolaseAB + H2OAOH + BH异构酶催化各种同分异构体的相

7、互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应5、异构酶 IsomerasesABPP合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸6、合成酶 Ligases or SynthetasesA + B + ATPAB + ADP +Pi酶的系统编号：4位数字第一位：代表六大类反应类型第二位：亚类（作用的基团或键的特点）第三位：亚亚类（精确表示底物/产物的性质）第四位：在亚亚类中的序号乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第1大类，氧

8、化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的编号第二节 酶的结构与功能的关系一、酶的化学本质及分类经酸碱水解终产物是AA能被蛋白酶水解而失活酶可变性失活酶是两性电解质酶溶液为胶体溶液，不能通过半透膜等具有蛋白质的化学呈色反应化学本质是蛋白质（一）酶的化学本质1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNAribozyme（核酶），以后又陆续发现了真正的RNA催化剂。第二节 酶的结构与功能的关系单体酶（monomeric enzyme）：一般由一条肽链组成寡聚酶（oligomeric enzyme）：为寡聚蛋白，2个亚基多酶体系（multienzyme

9、complex）：几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。由数个独立的酶组合起来形成络合体，催化一系列反应。（如糖代谢、脂代谢） 单纯酶 ：只有蛋白质 结合酶（缀合酶）：蛋白质多肽链 + 辅助因子辅助因子辅基辅酶与酶结合紧与酶结合松全酶第二节 酶的结构与功能的关系辅助因子的化学本质有金属元素、小分子有机物两类，多数维生素以其衍生物形式构成酶的辅酶或辅基，起着传递氢、电子、原子或化学基团等作用。某些金属元素起着底物与酶蛋白间“搭桥”等作用。一些金属离子与酶的活性有关，发挥激活功能结合酶中： 单独酶蛋白或辅助因子没有催化活性一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合同种辅助因子可与不同的酶蛋白结合 定义：与酶的催化

10、活性直接相关的化学基团常见的必需基团：His的咪唑基、Ser-OH、 Glu的-COOH、Cys-SH位于酶的活性中心，直接与底物结合，或直接参与催化底物的反应少数必需基团位于活性中心以外，起着稳定分子构象作用，对催化活性起间接作用必需基团非必需基团（一）必需基团与活性中心接触残基、辅助残基、结构残基、非贡献残基二、酶的活性部位 ( active site ）对酶活性的发挥不起作用 结合中心：与底物结合 决定酶促反应的专一性 催化中心：促进底物发生化学变化 决定酶促反应的性质 活性中心活性中心 活性中心：酶分子上必需基团比较集中并构成一定空间构象、与酶的活性直接相关的结构区域羧肽酶NADPH脱

11、氢酶的辅酶过氧化氢酶底 物 活性中心以外的必需基团结合基团催化基团 活性中心 AspHisSer胰凝乳蛋白酶的活性中心活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser195为Tyr 248为Arg 145为Glu 270为底物Zn羧肽酶活性中心示意图酶活性中心的一级结构同一类酶的活性中心一级结构的氨基酸顺序相似活性中心的形成要求酶蛋白分子具有一定的空间构象 酶活与高级结构只有高级结构才能形成活性中心四、酶原的激活 酶原(zymogen)：酶的无活性的前体 酶原的激活：由无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。 酶原激活的意义：在特定的环境和条件下发挥作用；避免细胞自身消化；有的酶原可以

12、视为酶的储存形式。 酶原激活的机理:酶 原分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下 第三节 酶作用的机制 一般催化剂反应活化能反应总能量变化酶促反应活化能非催化反应活化能初 态终 态能 量 改 变活 化 过 程酶促反应降低活化能过渡态二、中间产物学说底物同酶结合成中间产物是一种非共价结合，依靠氢键、离子键、范德华力等次级键来维持S+EESE+P（一）底物和酶的邻近效应和定向效应 三、决定酶作用效率高的机制 底物分子浓集于酶的活性中心，提高了底物的有效浓度，反应基团在反应中彼此相互严格地定向酶活性中心提供H+/H+受体使敏感键断裂酸催化

13、(OH、NH3+、NH+、-COOH、SH)A- : H+EHE-H2OEH + OH-+ H+AH + B+碱催化(失电子态)A- : B+ E-COO-A- + E-COOH E-COO- + H+（三）酸碱催化酶活性中心亲电/亲核基团参与S敏感键断裂的机制。亲电基团带正电荷性质的基团亲核基团带负电荷性质的基团（二）共价催化A- : B+ -OH - NH2 咪唑基 亲电催化2A- : 2 B+ Mg2+A: MgA + 2B+亲核催化-OH-SHA- : + HO :B 中间产物不稳定，断裂，形成产物，酶复原。（不同酶促反应中的催化因素影响大小不同。）1、需要金属离子的酶（1） 金属酶

14、(metalloenzyme)含紧密结合的金属离子（2）金属激活酶( metal-activited enzyme)含松散结合的金属离子（四）金属离子催化2、金属离子的作用 A、参与底物反应的定向 B、通过价态改变参与电子转移 C、通过静电稳定/屏蔽负电荷（1）锁钥学说刚性构象（2）诱导契合学说（3）结构性质互补学说 静电效应、极性相同（4）三点附着学说 立体异构专一性的酶二、与酶专一性有关的学说锁钥学说认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样诱导契合学说酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.

15、（Koshland，1958）：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。羧肽酶的诱导契合模式结构性质互补学说结合的专一性，与底物结构和酶活性中心的空间结构相关，二者的结构互补第四节 酶促反应的动力学一、米-曼氏方程早期的研究发现，如果酶促反应的底物只有一种（单底物反应），在其他条件不变的条件下，当酶浓度也不变时在底物浓度较低时，反应速度随着底物浓度的增加而快速增加，反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应当底物浓度较高时，增加底物浓度，反应速度随之增加，但不如低浓度时迅速，表现为混合级反应当底物浓度足够高时，反应速度不再增加

16、，表现为零级反应一、米-曼氏方程1、米氏方程的提出1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程(Michaelis equation)，对这个现象进行了解释。米氏方程的假设底物浓度远远大于酶浓度测定的速度为反应的初速度ES解离成E、S的速度显著快于ES转变成P+E的速度S：底物浓度V：不同S时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximum velocity) s：米氏常数(Michaelis constant) vVmaxS Km + S 二、米氏常数的意义米氏常数据是反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。单位为摩尔浓度米氏

17、常数是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关Km是在固定的底物、温度、pH下的常数Km可以反映酶同底物的亲和力酶的Km在实际应用中的意义鉴别不同来源、不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否为同一酶判断酶的最适底物计算一定速度下的底物浓度了解体度酶与底物浓度间的关系判断反应方向与趋势推测代谢途径判断酶被抑制的类型 第五节 影响酶作用的因素一. 温度对酶促反应速度的影响 酶促反应与其它化学反应一样，随温度的增加，反应速度加快。化学反应中温度每增加10反应速度增加的倍数称为温度系数Q10。一般的化学反应的Q10为23，而酶促反应的Q10为12。 在一定范围内，反应速度达到最大时对应

18、的温度称为该酶促反应的最适温度（optimum temperature Tm）.一般动物组织中的酶其最适温度为3540，植物与微生物中的酶其最适温度为3060，少数酶可达60以上，如细菌淀粉水解酶的最适温度90以上。 温度对酶促反应速度的影响： 1. 温度影响反应体系中的活化分子数：温度增加，活化分子数增加，反应速度增加。2. 温度影响酶的活性：过高的温度使酶变性失活，反应速度下降。 最适温度不是酶的特征常数，因为一种酶的最适温度不是一成不变的，它要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂、酶反应时间等因素的影响。因此，酶的最适温度与其它反应条件有关。二. pH对酶促反应速度的影响 大多数酶的活性受

19、 pH 影响显著，在某一 pH 下表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力显著下降。酶表现最大活力时的pH称为酶的最适pH。 典型的酶速度-pH曲线是较窄的钟罩型曲线，但有的酶的速度-pH曲线并非一定呈钟罩型。如胃蛋白酶。 胃蛋白酶的速度- pH曲线如下图： 胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲线 ： pH对酶促反应速度的影响机理：1、pH影响酶和底物的解离: 酶的活性基团的解离受pH影响，底物有的也能解离，其解离状态也受pH的影响，在某一反应pH下，二者的解离状态最有利于它们的结合，酶促反应表现出最大活力，此pH称为酶的最适pH；当反应pH偏离最适pH时，酶促反应速度显著下降。2、pH影响

20、酶分子的构象：过高或过低pH都会影响酶分子活性中心的构象，或引起酶的变性失活。 动物体内多数酶的最适pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最适pH约1.8，肝精氨酸酶最适pH约为9.8(见下表)。 一些酶的最适pH 三. 酶浓度的影响在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大于100 Km时（底物浓度大大超过酶浓度），速度与酶的浓度呈正比。酶浓度对速度的影响机理：酶浓度增加，ES也增加，而V=k3ES，故反应速度增加。1903年Henri用蔗糖酶水解蔗糖，研究底物浓度与反应速率的关系；绘制了底物浓度与反应关系的曲线图提出了酶底物中间络合物学说回顾：底物浓度对酶反应速率的影响当底物浓度较低时反应

21、速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。SVVmax随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。SVVmax当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应SVVmax酶催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成中间复合物，然后生成产物，并释放出酶。（一）中间络合物学说（二）酶促反应的动力学方程式1、米氏方程1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程(Michaelis equation)。 研究前提单底物、单产物反应；酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来

22、表示；反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度；底物浓度远远大于酶浓度。（S E）三个假设：（1）E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而 ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 Vk3ES。（2）S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即SSt。 （3）P0 忽略 这步反应 S：底物浓度V：不同S时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximum velocity) s：米氏常数(Michaelis constant) VmaxS Ks + S 四. 激活剂对酶反应速度的影响 能使酶活性提高的物质，都称为激活剂(ac

23、tivator)，其中大部分是离子或简单的有机化合物。如Mg+是多种激酶和合成酶的激活剂，动物唾液中的-淀粉酶则受Cl-的激活。 特点：1、酶对激活剂有一定的选择性，一种酶的激活剂对另一种酶来说可能是抑制剂 2、有一定的浓度要求，当激活剂的浓度超过一定的范围时，它就成为抑制剂。 五、抑制剂对反应速度的影响 凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂(inhibitor)。 使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。 （一）酶的抑制作用失活作用：使酶Pr变性而引起酶活力丧失。无选择性抑制作用：酶的必需基因的性质受到某种化学物质的影响而发生阻断或改变，导致酶活活

24、降低或丧失。酶活力下降但不引起变性。有选择性抑制剂：能引起抑制作用的物质。去激活作用：例：EDTA能够去除一些有抑制作用的金属离子 依据： 能否用透析、超滤等物理方法 除去抑制剂，使酶复活。不可逆抑制：抑制剂与酶活性中心必需基团共价结合，引起酶活丧失。非专一性不可逆：一种抑制剂可作用于酶分子上不同基团或作用于几类不同的酶专一性不可逆：通常只作用于一种氨基酸侧链基团或仅作用于一类酶可逆抑制：抑制剂与酶蛋白以非供价键结合（二）抑制作用的分类1）竞争性抑制(competitive inhibition)(1)含义和反应式 抑制剂I和底物S结构相似，抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥

25、，已结合底物的ES复合体，不能再结合I。同样已结合抑制剂的EI复合体，不能再结合S。（2）特点： 抑制剂I与底物S在化学结构上相似，能与底物S竞争酶E分子活性中心的结合基团. 例如，丙二酸、苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。 抑制程度取决于抑制剂与底物的浓度比、ES和EI的相对稳定性；加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。 很多药物都是酶的竞争性抑制剂。例如磺胺药与对氨基苯甲酸具有类似的结构，而对氨基苯甲酸、二氢喋呤及谷氨酸是某些细菌合成二氢叶酸的原料，后者能转变为四氢叶酸，它是细菌合成核酸不可缺少的辅酶。由于磺胺药是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂，进而减少细

26、菌体内四氢叶酸的合成，使核酸合成障碍，导致细菌死亡。抗菌增效剂-甲氧苄氨嘧啶(TMP)能特异地抑制细菌的二氢叶酸还原为四氢叶酸，故能增强磺胺药的作用。磺胺药物的抑菌作用2）非竞争性抑制(non-competitive inhibition) (1)含义和反应式 酶与底物结合后，可再与抑制剂结合，酶与抑制剂结合后，也可再与底物结合。在抑制剂存在的情况下，增加底物浓度不能达到没有抑制剂存在时的最大速度。 （2）特点： I和S在结构上一般无相似之处，I常与酶分子上结合基团以外的化学基团结合，这种结合并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不能减少I对酶的抑制。 非竞争性抑制剂并不影响酶促反应的Km值，

27、而是使Vmax值变小3）反竞争性抑制 (1)含义和反应式 反竞争性抑制剂只能与酶-底物中间复合物结合，使得Km、Vmax都变小。 第六节 酶活力的测定一、酶活力的测定 由于从生物原材料中提取出来的酶纯度有限，仅依据体积与质量不能评估酶的多少，需要知道酶制剂具有多大的催化能力。测定酶活力的方法测定一定时间内的化学反应量测定完成一定量反应的时间酶活力单位酶活力单位：单位时间内被酶作用的底物的减少量或产物的生成量IU(International unit):在最适反应条件（温度25）下， 1分钟内催化1微摩尔底物转化的酶量为一个酶活力单位（1961年，国际生化协会酶学委员会）（二）酶的活力单位： 1

28、961年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（IU）规定为：在最适反应条件（温度25）下，每分钟内催化1微摩尔（mol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位。 测定条件：最佳的反应条件，如最适的T（或25）、最适pH、S E、初速度下。 1972年国际生化协会又推荐一种新单位，即Katal(Kat)单位。规定：在最适温度下，每秒钟能催化1摩尔底物转化的酶量定义为 1 Kat。1 Kat=60106 IU .(三)酶的比活力： 每单位酶蛋白（或每毫克蛋白氮）所含的活力单位数。 对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位/mg酶蛋白氮来表示；

29、 对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。 很明显，比活力越大，酶越纯。（五）酶活力的测定方法1、分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法。2、测压法：产物中有气体，测气压增加量。3、滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。4、荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂 反应生成荧光产物可用此法。5、旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。 除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。 第七节 酶的多样性一、变构酶与变构调节（一）调节酶：凡能通过构象变化或亚基解聚或亚基修饰等方式来改变酶活性而对代谢起调节作用的酶称为调节酶。 变构酶又称为别构酶，指调节物与酶分子

30、的调节部位以非共价键结合后，引起酶的构象的改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节作用称为变构调节，具有变构调节的酶称变构酶。凡能使酶分子发生别构作用的物质称为变构剂或调节物调节物能使酶活性增加的效应叫正协同效应，该调节物叫正调节物（如底物）调节物能使酶活性降低的效应叫负协同效应，该调节物叫负调节物酶的别构（变构）效应示意图效应剂别构中心活性中心别构酶的反馈调控机理A （产物或中间产物）EDCB关键酶 二、共价调节酶 1、概念： 也称共价修饰酶，通过其它酶对其多肽链某些基团进行可逆共价修饰，使处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性；共价修饰主要是磷酸化、腺苷酰化、甲基化等。共价调节酶是寡聚酶，且在每个亚基上都含有共价修饰的位点。 三 、同工酶 同工酶(isoenzyme)是指催化的化学反应相同，酶蛋白的分子组成形式、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。如乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH），具有多种分子组成形式：LDH5（M4）、LDH4（M3H）、LDH3（M2H2）、LDH2（MH3）、LDH1（H4）。乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽亚基mRNA四聚体结构基因a b乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱+H4MH3M2H2M3HM4点样线 LDH同工酶有组织特异性，LDH1