细菌光修复实验的设计和改进

1、细菌光修复实验的设计和改进摘要：目前关于DNA损伤和修复的实验教学尚属空白，学生在学习相关知识过程中难以深入 掌握知识点.设计切实可行的相关实验教学方法，是生物化学实验教学过程中一个迫切需要解决的 问题.该文设计了一种高效直观的细菌光修复实验.首先利用碘化钾一碘酸钾化学光强计方法测量 低压汞灯紫外光强，并在红色LED光源照明下对菌液进行紫外光照.紫外损伤后的菌液利用白色 LED光源进行光修复，然后对经过紫外损伤和光修复后的菌液进行梯度稀释，取稀释的菌液进行点 板，隔日进行菌落计数并进行数据分析.实验结果表明，细菌在经过紫外损伤后菌落数逐渐减少，而 经过光修复后菌落数逐渐恢复.该方法可以直观地观

2、察细菌的紫外损伤和光修复，并且实验操作简 便、成本低、效率高，具有较强的实用价值.关键词：紫外损伤；光修复；实验教学；点板法；菌落计数DNA是包括人体在内绝大多数生物体的 遗传物质，其稳定性是遗传保守性的基础.然 而，多种因素可能导致DNA出现损伤，进而影 响遗传信息的表达和传递，导致细胞生长停 滞、衰老、死亡，使机体引起炎症、甚至肿瘤等 多种疾病.DNA损伤的修复，是生物体维持 DNA正常结构，保持细胞正常功能，防止一系 列疾病发生的重要手段1-2.由于DNA修复的 重要性，该领域的研究日益受到人们的关 注.2015年，科学家托马斯林达尔、保罗莫 德里克、阿齐兹桑贾尔被授予诺贝尔化学 奖，以

3、表彰他们在DNA修复方面的卓越研究 成果3-5.目前，在本科生物化学课程的理论 教学中，DNA的损伤和修复内容已单独列为 一个章节进行讲解.然而，关于DNA损伤和 修复的实验教学，目前尚属于空白.这使得学 生在学习相关知识的过程中，出现理论和实 践的脱节，难以深入掌握相关知识点.设计切 实可行的相关教学实验，是生物化学教学中 亟待解决的课题.中短波紫外线（波长200 nm315 nm）可 导致DNA链上相邻的嘧啶碱基发生共价交 联，形成嘧啶二聚体损伤.很多生物体存在光 修复酶（photolyase），可吸收利用波长为315 nm 500 nm的长波紫外线和可见光的能量，直接 修复紫外线造成的嘧

4、啶二聚体损伤，此过程 称为光修复，也是阿齐兹桑贾尔获诺贝尔奖 的研究内容之一.我们以光修复现象为出发 点，设计了细菌的光修复实验，并对实验进行 了合理改进，使实验更加便捷、高效，以适合 本科实验教学的需要.同时该实验方法也适 用于光修复的相关科学研究.1材料与方法1.1器材超净工作台、培养箱、恒温空气摇床、台 式离心机、高压灭菌锅、-80 t冰箱、分光光度 计、试管、培养皿、接种环、涂棒、酒精灯、计时 器、低压汞灯（发射波长254 nm）、白色LED光 源、红色LED光源（发射波长635 nm）、手术盘 盖、遮光窗帘、微量移液器、紫外护目镜、防护 手套.1.2菌株和试剂菌株为大肠杆菌DH5a，

5、为本实验室保 存.LB培养基：胰蛋白胨（10g/L）,酵母提取物 （5 g/L），NaCl（10g/L）；固体培养基加1%琼脂 粉，灭菌后倒平板.生理盐水：0.9% NaCl.化学 光强计母液 A 液：NazBO, - 10H2O 0.38g，KI 9.96 g，定容到 50 mL ；B 液：KIO3 2.14 g，定容 到 50 mL.1.3实验操作（1）低压汞灯紫外光强的测量.方法根据 文献8改编.取化学光强计母液A液和B液 各2.5 mL混合，加入敞口的培养皿（直径7 cm）， 置于低压汞灯垂直下方50 cm处，用手术盘盖 住.打开低压汞灯预热5 min，其间操作者戴 好紫外护目镜和防护

6、手套.揭开手术盘，同时 计时光照.计时结束同时将手术盘盖上，关 灯，取少量样品稀释10倍后检测352 nm吸光 度变化.重复若干次，记录光照时间和352 nm 吸光度，并作图分析计算光强.（2）细菌培养和菌落计数.取冻存保种菌 在LB固体培养基平板进行划线培养，37 2培 养过夜，长出单菌落后，从平板上挑取一个单 菌落接于2 mL LB液体培养基的试管中，37 2 振荡培养过夜.取培养好的菌液，用生理盐水 稀释100倍，然后以10倍梯度连续稀释至10-7 倍.取不同稀释梯度的菌液100 L分别在LB 固体培养基涂板，同时在LB固体培养基上按 照浓度梯度取5 L菌液点板，37 2避光培 养，隔日

7、对平板上菌落进行计数.做三次平行 实验.（3）细菌的紫外损伤和光修复实验.将实 验室的遮光窗帘拉上，创造一个暗环境，照明 采用红色LED光源，防止不必要的光修复.取 100 L菌液置于剪下的灭菌EP管盖中并将 其置于低压汞灯垂直下方50 cm处，用手术盘 盖住.打开低压汞灯预热5 min，其间操作者 戴好紫外护目镜和防护手套.揭开手术盘同 时光照并计时，计时结束同时将手术盘盖上， 关灯.将菌液用生理盐水按不同浓度梯度稀 释后分别涂板和点板培养，隔日对平板上菌 落进行计数.将紫外照射的菌液在暗处孵育 10 min后放置于白色LED灯垂直下方10 cm 处，用手术盘盖住.打开白色LED灯，揭开手

8、术盘，同时计时光照.计时结束同时将手术盘 盖上，关灯.将菌液用生理盐水按不同浓度梯 度稀释后分别涂板和点板，37 t避光培养，隔 日对平板上菌落进行计数.做三次平行实验.将紫外照射后部分损伤的菌液放在暗处 孵育0 min、5 min、 10 min、 20 min、 40 min 后开 始白色LED光照并计时，取样后用生理盐水 按不同浓度梯度稀释后点板37 t避光培养， 隔日对平板上菌落进行计数.做三次平行实 验，探究暗处孵育对紫外损伤后的菌液光修 复的影响.2结果2.1化学光强计测量紫外光强碘化钾一碘酸钾化学光强计的原理是碘 化钾和碘酸钾在光子的催化下，生成L，产 物在352 nm具有吸收峰

9、，消光系数为27 600 L/（mol-cm），量子产率为0.73.测量紫外吸收 光谱时取少量样品稀释10倍测量.根据测量 结果作图分析，计算出紫外光强（图1）.图1碘化钾-碘酸钾化学光强计测量结果从图1可以看出，取352 nm处的吸光度对 紫外光照时间作图后，经线性拟合RJ0.987， 斜率0.068 6，表明紫外光强约为2.11 W/m2.计算得到352 nm处I3的生成速率为0.119 6， 因此I3的摩尔数=0.005xA352 nm/27 600，其中 0.005是样品体积（5 mL）除以1升（1 000 mL） 的体积的比值，27 600是摩尔消光系数.通过 光强计算公式I = N

10、hv/St计算可得本次实验的 光强=2.11 W/m2.其中：v表示光的频率，S为照 射区域面积，N为时间间隔t内照到S上的光 子总数，h是普朗克常数.2.2细菌的菌落计数一一涂板法和点板法的 比较涂板法和点板法所得到的菌落数接近， 但点板法和涂板法相比较，所用的培养皿、实 验耗材相对较少，所耗时间也比较少，细菌存 活率变化更加直观，因此我们在后续的试验 中均采用点板法进行.2.3细菌的紫外存活率和光修复效率的测定将紫外照射后的菌液梯度稀释进行点板 培养，隔日进行菌落计数.按照同样的方法将 紫外照射后的菌液置于白色LED灯下进行光 修复.通过作图测定出细菌的紫外存活率和 白光的修复效率.DH5

11、a紫外光照后的计数结 果及DH5a光修复后的计数结果分别如图2 和图3所示.（a）菌落照片（b）菌落数随紫外剂量变化图 图2 DH5 a紫外光照后计数结果(a)菌落照片i/min(b)菌落数随光修复时间变化图 图3 DH5a光修复后计数结果3讨论与结论低压汞灯又名紫外灭菌灯，其发射波长 为254 nm，正好位于DNA和蛋白质吸收峰附 近，容易造成DNA等生物大分子损伤.低波长 紫外线可引起DNA同一条链上相邻的嘧啶碱 基形成二聚体结构(TT)，导致DNA的双螺旋 结构发生改变，使复制与转录过程受阻，从而 抑制细菌生长或杀死细菌9.在大肠杆菌 (DH5a)中存在一种DNA光修复酶(DNA pho

12、tolyase)， 能够识别并结合损伤的嘧啶二聚体， 在可见光(400 nm)激发下，修复紫外造成的 DNA损伤市面的紫外光强计昂贵且准 确度低，不适用于本科实验教学.在紫外损伤 细菌实验中，我们采用了碘化钾一碘酸钾化 学光强计进行紫外光强的间接测量，科学合 理地测量出不同规格的低压汞灯的紫外剂 量，与传统的草酸铁钾光强计12相比，其在紫 外区准确度更高，且对可见光不敏感，学生能 够高效简便地重复实验.为准确，但是存在可计数浓度范围窄、计数准 确度低、涂布不均和计数工作量大等问题，容 易造成较大的实验误差.与涂板计数法13相 比，点板法具有所需样品量少、点样区域小， 检测范围广，计数简便等优点

13、.这种方法不仅 可以直观地反映不同浓度下菌落数的变化， 而且可以降低实验成本，提高实验效率.为了 让学生更直观地了解光修复的原理，采用点 板法设计细菌紫外损伤和光修复实验更加合 理.在一定范围内，细菌经过紫外损伤后菌落 数逐渐减少，光修复实验后菌落数逐渐增加， 在同一块培养皿上可以直观地看出这种变 化.此外，在实验过程中我们采用红色LED光 源照明，波长(635 nm)较为单一，可以有效防 止照明光源对细菌的光修复.一定量的紫外线照射后的大肠杆菌黑暗 条件下被保存在缓冲液或盐水中时，能够在 复杂培养基上形成菌落的细胞数量逐渐增 加14-15，这被称为液体复苏持有(Liquid holding recovery， LHR).紫外照射后在黑暗处保存不 同的时间开始计时光照，取样点板，结果显 示，短暂的暗处孵育对细菌的光修复影