实验1大肠杆菌的培养和分离

1、什么是微生物？乳酸杆菌黑曲霉微生物：结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。第一页，共三十七页。什么是培养基？三角瓶培养皿试管液体培养基：扩大培养，工业生产。固体培养基：分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏。凝固剂：琼脂第二页，共三十七页。培养基的配制营养成分功能和来源碳源氮源生长因子水无机盐提供碳元素：主要是糖类提供氮元素：蛋白胨、牛肉膏、尿素维生素、氨基酸和含氮碱基H2O，良好的溶剂NaCl：维持一定的渗透压第三页，共三十七页。LB 培养基的配制LB固体培养基：蛋白胨 0.5g，酵母提取物 0.25g，氯化钠 0.5g，加水50 mL，琼脂 1g。调节pH 至7.6。封口膜第

2、四页，共三十七页。菌落：单细菌的克隆菌落：在固体培养基上，由单个细菌繁殖而来的一个肉眼可见的具有特定形状的子细胞群体。霉菌大肠杆菌第五页，共三十七页。菌落的作用：鉴定菌种的重要依据菌落特征：菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。第六页，共三十七页。大肠杆菌大肠杆菌：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。第七页，共三十七页。怎样无菌操作？高压蒸汽灭菌：培养皿、试管、三角瓶、枪头、玻璃三角刮刀、接种环、镊子。在121下灭菌15 min。高压蒸汽灭菌锅第八页，共三十七页。培养皿三角瓶玻璃三角刮刀接种环微量移液器枪头第九页，共三十七页。棉花塞、封口膜、牛皮纸或旧报纸、橡皮筋不能用脱脂棉：易吸水，容易引起污染。

3、第十页，共三十七页。酒精灯和酒精棉球灭菌：杀死所有微生物。消毒：杀死部分微生物（不包括芽孢和孢子）。第十一页，共三十七页。超净工作台打开紫外灯和过滤风，灭菌30 min。点燃酒精灯酒精棉擦拭桌面酒精棉球擦手。酒精灯火焰附近旁进行灼烧灭菌防止杂菌污染第十二页，共三十七页。用细菌过滤器除菌：尿素加热会分解，用G6玻璃砂漏斗过滤。第十三页，共三十七页。什么是倒平板？将灭菌后的固体培养基倒入已灭菌的培养皿中，冷却凝固后制成的培养基。第十四页，共三十七页。Step1：培养基的配制和灭菌将50 mL LB液体培养基、50 mL LB固体培养基和培养皿进行高压蒸汽灭菌。无菌水培养皿用牛皮纸包扎第十五页，共三

4、十七页。Step2：倒平板在酒精灯火焰旁将三角瓶中的固体培养基（冷却到60）倒入灭菌的培养皿中，置于水平放置上，并轻轻晃动，待凝固后形成平面。超净台第十六页，共三十七页。Step3：接种后扩大培养将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中，使其在37摇床培养12 h 。恒温摇床第十七页，共三十七页。Step4：平板划线分离用接种环在培养大肠杆菌的三角瓶中蘸取菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线。将培养皿倒置，放在37 恒温箱中培养1224 h。第十八页，共三十七页。怎样在平板上划线？1次2次3次4次连续划线法分区划线法第十九页，共三十七页。原因：随着划线次数的增加，菌数越来越少，最

5、终在划线的末端出现由一个细菌繁殖而来的单个菌落。为什么通过划线分离可得到单菌落？第二十页，共三十七页。原因：既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基中造成污染。恒温培养时培养皿倒置培养皿倒置皿盖皿底恒温培养箱第二十一页，共三十七页。Step5：菌种的斜面保存将接种环将单菌落取出，用划线法接种在斜面培养基上，37培养24 h后，置于4冰箱中保存。斜面培养基第二十二页，共三十七页。试管斜面培养基的制作方法：将未凝固的含有琼脂的培养基加入试管中，灭菌后将试管斜放，令其冷却，固体培养基即成为斜面。第二十三页，共三十七页。平板划线分离法灼烧接种环外焰先灼烧后冷却：以免接种环温

6、度太高，杀死菌种。第二十四页，共三十七页。接种环冷却后，蘸取带菌培养物第二十五页，共三十七页。在近火焰处，让带菌接种环在固体培养 基上划线第二十六页，共三十七页。恒温培养箱中倒置培养分区划线法每次划线之前都要灼烧接种环。总是从上一次划线的末端开始划线。第二十七页，共三十七页。稀释涂布分离法用无菌吸管吸取1mL细菌培养液加入另一个盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液。梯度稀释菌液：10-510-7倍第二十八页，共三十七页。滴加菌液用无菌吸管取0.1mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。第二十九页，共三十七页。用玻璃刮刀涂布玻璃涂棒第三十页，共三十七页。将玻璃刮

7、刀放在酒精灯火焰上灼烧，待玻璃刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个培养基表面。第三十一页，共三十七页。将培养皿倒置，在37恒温箱中培养2448 h。 恒温培养箱中培养恒温培养箱第三十二页，共三十七页。结果：以每个培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。10-110-210-310-410-5第三十三页，共三十七页。第三十四页，共三十七页。倒平板平板划线分离练一练，识一识稀释涂布分离接种环玻璃刮刀第三十五页，共三十七页。例题：要获得遗传特性单一的大肠杆菌菌种，一般必须对原有的大肠杆菌菌种进行扩大培养，并利用纯化技术得到单菌落的菌种。请回答下列有关大肠杆菌的培养和分离实验的相关问题：（

8、1）对买回来的大肠杆菌菌种进行扩大培养，一般用LB培养基，在培养基中为微生物提供碳源、氮源和能源的物质主要是，为调节渗透压，要加入一定量的。为进行大肠杆菌的分离，还要加入 配制成固体培养基，并进行倒平板的操作。蛋白胨和酵母提取物氯化钠琼脂第三十六页，共三十七页。（2）获得纯净微生物培养物的关键是，为此，必须对培养器皿、接种用具和培养基进行严格灭菌。培养器皿和培养基一般采用 法灭菌，接种环采用灼烧法灭菌。同时在接种或倒平板操作时，除了在超净台上进行操作并对实验者的衣着、手和实验空间进行严格清洁和消毒外，还必须 以防止空气中的杂菌污染。（3）大肠杆菌菌种的扩大培养一般采用液体培养基，接种后将培养基置于37摇床振荡条件下培养12 h。菌种的分离一般在固体培养基上