发酵工程02第二章 发酵菌种选育

第二章生生产产中常用用菌种的的分离、、选育和和保藏第一节菌菌种的的分离筛筛选第二节培培养养分离第三节工工业微微生物育育种第四节菌菌种的的保藏及及活化带图象分分析系统统的微生生物菌种种

显微微观察装装置第一节菌菌种的分分离简介介一、菌种种的来源源根据资料料直接向向有科研研单位、、高等院院校、工工厂或菌菌种保藏藏部门索索取或购购买；从大自然然中分离离筛选新新的微生生物菌种种。二、分离离思路新菌种的的分离是是要从混混杂的各各类微生生物中依依照生产产的要求求、菌种种的特性性，采用用各种筛筛选方法法，快速速、准确确地把所所需要的的菌种挑挑选出来来。实验室或或生产用用菌种若若不慎污污染了杂杂菌，也也必须重重新进行行分离纯纯化。有了优良良的菌种种，还要要有合适适的工艺艺条件和和合理先先进的设设备与之之配合。。定方案：：首先要查查阅资料料，了解解所需菌菌种的生生长培养养特性。。采样：有针对性性地采集集样品。。增殖：人为地通通过控制制养分或或培养条条件，使使所需菌菌种增殖殖培养后后，在数数量上占占优势。。分离：：利用分分离技技术得得到纯纯种。。发酵性性能测测定：：进行生生产性性能测测定。。这些些特性性包括括形态态、培培养特特征、、营养养要求求、生生理生生化特特性、、发酵酵周期期、产产品品品种和和产量量、耐耐受最最高温温度、、生长长和发发酵最最适温温度、、最适pH值、提提取工工艺等等。三、新新种分分离与与筛选选的步步骤菌种筛筛选主主要步步骤调查研研究及及查阅阅充分分的资资料↓↓设设计计实验验方案案↓↓确定定采集集样品品的生生态环环境采采样样↓↓确定定特定定的增增殖条条件增增殖培培养↓↓确确定特特殊的的选择择培养养基及及可能能的↓↓定定性或或半定定量快快速检检出法法平平板板分离↓原种斜斜面↓↓确确定发发酵培培养基基础条条件筛筛选选↓↓初初筛筛（1株1瓶））↓↓复复筛（（1株株3～～5瓶瓶）↓↓结结合初初步工工艺条条件摸摸索再再复筛筛（1株3～5瓶））↓↓3～5株↓↓单单株株纯种种分离↓生生产性性能试试验↓↓→→毒性性试验验菌菌种鉴鉴定（一）采采样1、采采样对对象以采集集土壤壤为主主。一般园园田土土和耕耕作过过的沼沼泽土土中，，以细细菌和和放线线菌为为主；；富含含碳水水化合合物的的土壤壤和沼沼泽地地中，，酵母母和霉霉菌较较多，，如一一些野野果生生长区区和果果园内内。采样的的对象象也可可以是是植物物，腐腐败物物品，，某些些水域域等。。从自然然界筛筛选2、采采样季季节：：以温温度适适中，，雨量量不多多的秋秋初为为好。。3、采采土方方式：：在选选好适适当地地点后后，用用小铲铲子除除去表表土，，取离离地面面5-15cm处的的土约约10g，，盛入入清洁洁的牛牛皮纸纸袋或或塑料料袋中中，扎扎好，，标记记，记记录采采样时时间、、地点点、环环境条条件等等，以以备查查考。。为了了使土土样中中微生生物的的数量量和类类型尽尽少变变化，，宜将将样品品逐步步分批批寄回回，以以便及及时分分离。。（二））增殖殖培养养为了容容易分分离到到所需需的菌菌种，，让无无关的的微生生物至至少是是在数数量上上不要要增加加，可可以通通过配配制选选择性性培养养基，，选择择一定定的培培养条条件来来控制制。例如碳碳源利利用的的控制制，可可选定定糖，，淀粉粉、纤纤维素素，或或者石石油等等，以以其中中的一一种为为唯一一碳源源，那那么只只有利利用这这一碳碳源的的微生生物才才能大大量正正常生生长，，而其其它微微生物物就可可能死死亡或或淘汰汰。这这样对对下阶阶段的的纯种种分离离就会会顺利利得多多。（三））培养养分离离尽管通通过增增殖培培养效效果显显著，，但还还是处处于微微生物物的混混杂生生长状状态。。因此此还必必须分分离，，纯化化。在在这——步，，增殖殖培养养的选选择性性控制制条件件还应应进一一步应应用，，而且且控制制得细细一点点，好好一点点。纯纯种分分离的的方法法有划划线分分离法法、稀稀释分分离法法。1.稀稀释平平皿分分离法法1.稀稀释平平皿分分离法法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀释释1.稀稀释平平皿分分离法法b.涂涂布平平皿分分离法法a.倾倾注平平皿分分离法法2.平平皿划划线分分离法法a.连连续续划线线分离离法b.分分区划划线分分离法法（四）筛选选这一步是采采用与生产产相近的培培养基和培培养条件，，通过三角角瓶的容量量进行小型型发酵试验验，以求得得适合于工工业生产用用菌种。（五）毒性性试验自然界的一一些微生物物是在一定定条件下产产毒的，将将其作为生生产菌种应应当十分当当心，尤其其与食品工工业有关的的菌种，更更应慎重。。据有的国国家规定，，微生物中中除啤酒酵酵母、脆壁壁酵母、黑黑曲霉、米米曲霉和枯枯草杆菌作作为食用无无须作毒性性试验外，，其他微生生物作为食食用，均需需通过两年年以上的毒毒性试验。。第二节培培养分离离从自然界中中分离培养养微生物是是菌种选育育的重要和和基础的步步骤。到目前为止止，还没有有一种分离离培养方法法能揭示一一个试样中中所包含的的所有微生生物总数和和种类。在任一试样样中所存在在的微生物物仅为极少少数特定种种类的菌株株；在工业业微生物筛筛选过程中中，应及时时调整检测测方法，以以与各种不不同类型的的生长和代代谢之微生生物相适应应。因此，建立立一更为科科学的和针针对性不强强的分离方方法是必要要的。一、成功的的分离培养养方法(1)认真真考它所需需产品的特特征和生产产过程；(2)制订订初步的筛筛选标准；；(3)将生生态学方法法运用到分分离和筛选选过程。三、将生态态学方法用用于培养分分离的一般般思路要点点1．罗列出出所要分离离的微生物物类群；2．根据所所采集样本本的各种生生态参数，，描述所要要分离的微微生物之生生态系统或或栖息地：：3．将若干干样本分成成若干类型型，如植物物和植物各各部，土壤壤(类型和和土层)、、岩石、水水、昆虫和和发酵食品品等；4．罗列出出所要考察察和测量的的环境参数数，如pH、盐分、、水分、氧氧化还原电电势及温度度等；5．列出生生物系统中中有用的自自然底物，，如森林土土壤中的几几丁质、葡葡萄表皮的的果胶；6．根据上上述1-5项中所获获得的数据据，设计分分离方法，，即选择适适宜的稀释释液、底物物、试样、、天然浸出出汁和培养养条件；7．用标准准方法作对对照来评价价生态学分分离方法；；8．根据待待检材料的的生态参数数需要，修修改已知的的方法；9．运用特特定的富集集方法，富富集那些可可能具有筛筛选意义的的微生物类类群。四、自然界界中细菌的的分离(一)采样样和采集方方法为了从一特特定生态系系统中分离离出具有代代表性的细细菌菌群，，特别是分分离那些在在唯一微环环境区域中中出现的菌菌群时，必必须十分重重视样本的的采集。样本采集时时所需的工工具通常有有无菌刮铲铲、土样采采集器、镊镊子、解剖剖刀、手套套、无菌小小塑料袋和和塑料瓶等等。采样的注意意事项1、采样时时应尽可能能保持相对对无菌；2、所采集集的样本必必须具有某某种代表性性；3、采好的的样必须完完整地标上上样本的种种类及采集集日期、地地点以及采采集地点的的地理、生生态参数等等；4、应充分分考虑采样样的季节性性和时间因因素，因为为真正的原原地菌群的的出现可能能是短暂的的；5、采好的的样应及时时处理，暂暂不能处理理的也应贮贮存于4℃℃下，但贮贮存时间不不宜过长。。这是因为为一旦采样样结束，试试样中的微微生物群体体就脱离了了原来的生生态环境，，其内部生生态环境就就会发生变变化，微生生物群体之之间就会出出现消长(二)生态学参数数及培养基基

的组成成原则1、加入培培养基中的的天然提取取物种类和和用量、环环境生物物物理学参数数以及用于于平板涂布布分离样本本的溶剂都都会影响实实验中所要要分离的细细菌的数量量和种类。。2、就分离离培养基的的组成而言言，部分培培养基中必必须含有10-50%的天然然提取物。。加入培养养基中的天天然提取物物，部分培培养基中则则应含有多多种碳、氮氮源，如几几丁质、纤纤维素或果果胶。3、所有分分离培养基基中都应含含有抗真菌菌剂(如放放线菌酮和和制霉素)，掺加浓浓度一般为为50μg／m1，，以抑抑制真菌的的生长。4、琼脂平平板在使用用前应置于于37℃培培养箱中孵孵育l、2天。5、培养基基的生物物物理学参数数，如pH及盐分也也应调节到到与试样的的生态系统统参数值相相近。二、分离目的微生物物不纯，需需分离纯化。采用用简便迅速速，有一定定准确性的的检出方法法，提高筛筛选效率。。常用平皿皿反应法：：纸片培养显显色法：浸浸有指示剂剂滤纸。透明圈法：混浊底底物被分解解后形成透明圈。如可溶性性淀粉、碳碳酸钙等。。

变色圈圈法：直接接用显色剂剂或指示剂剂。

生长长圈法：利利用某些具具有特殊营营养要求的的微生物作作为工具菌菌，要分离的微生物能能在一般培培养条件下下生长而合合成该营养养物而使工工具菌能生生长，形成成生长圈。。

抑制圈圈法：琼脂脂块培养法法。用刚果红染染色法鉴定定筛选降解解纤维素的的菌株羧甲基纤维维素钠作培培养物抗生素筛选选检定菌培养养，加上发发酵液五、放线菌菌的分离培培养基的组组成原则大多数放线线菌的分离离培养是在在贫脊或复复杂底物的的琼脂平板板上进行的的。除嗜温温性放线菌菌外，其他他放线菌一一般在培养养4-20天内在分分离平板上上缓慢形成成菌落。在放线菌分分离琼脂中中通常都加加入抗真菌菌剂制霉菌素或或放线菌酮酮，以抑制真真菌的繁殖殖。选择性地添添加抗生素素。分离琼脂平平板制备好好后，一般般皆应在37℃培养养箱中存放放3天。放线菌的分分离土样中放线线菌的非选选择性分离离：土样风干，磨碎，无无菌海绵压压印土样后后压印平板板后培养。。植物体上放放线菌的分分离：无菌菌取植物组组织，干燥以减少细菌菌数量，剪剪碎植物材材料后植入入平板表层层后培养。。也可洗下下微生物后后振荡培养养。水中放线菌菌的分离：：为使所所要分离的的放线菌的的数量种类类增多，一一般将水样样离心或滤滤纸过滤，，取离心沉积或或滤纸表面面沉积进行系列稀稀释和涂布布。次代培养及及纯化菌落形成后后可根据肉肉眼可见的的菌落形态态上的差异异，作初步步的鉴定和和区分。通过高倍放放大进行镜镜检，可了了解气生和和营养孢子子形成情况况。成功地分离离出各种不不同的放线线菌属及种种的关键是是所采集样样本的本身身及其分离离用的琼脂脂培养基；；而肉眼识识别不同的的生长形态态、从而初初步地加以以鉴定，在在分离放线线菌时显得得尤为重要要。将分离平板上上所形成的菌菌落用经火焰焰灼烧灭菌的的钩形针或无无菌牙签挑取取，点接到琼琼脂平板上进进行影印培养养，以进一步步筛选和分离离。放线菌菌落形形态六、真菌分离1、利用低碳碳／氮比的培培养基可使真真菌生长菌落落分散，利于于计数，分离离和鉴定。这这里主要是利利用营养成分分的减少而使使生长减慢，，并由此限制制真菌的迁徙徙生长。2、改变培养养温度将有利利于不同嗜温温区真菌的分分离。3、有时，真真菌子实体形形成必须有光光线，这在分分离培养时应应加以考虑。。4、选择性富富集：是通过过一定的方式式使样本中一一种或一群微微生物数量上上的增加而利利于分离的一一种技术。富集可以是种种水平的，如如通过营养要要求的改变来来富集分离镰镰刀菌；也可可以是组成群群水平的，如如以纤维素为为唯一碳源的的选择性培养养基可选择性性富集所有能能降解纤维素素的纤维素裂裂解微生物。。5、在分离培培养基中加入入一定的抗生生素即可有效效地抑制细菌菌生长及菌落落形成。真菌的分离方方法土中真菌的分分离：稀释法法，混入法，，压贴法，粘粘附法，浮选选法，注射器器采集法，土土过筛法，庶庶糖密度梯度度离心法。植物材料中真真菌的分离：：植入法，压压贴法，洗涤涤法，浸泡法法。水中真菌的分分离：水样稀稀释后涂布分分离。饵诱技技术常用于水水中真菌的富富集。子实体直接分分离培养担子子菌：新采集集的子实体组组织植入平板板内或在放于于液体培养基基表面放一小小块无菌滤纸纸上培养。七、生产选种种是在长年累月月的生产实践践中，在培养养工艺条件没没有任何可见见变更情况下下，突然发现现某些批次生生产水平提高高较大，这就就有可能是个个别自然变异异朝更好的方方向变的细胞胞，在这种条条件下很适应应于培养条件件，并逐渐显显示出它的生生长优势，这这种优势的发发展，促使它它优良的生产产性能表露。。第四节工工业菌种的育育种方针工业菌种的育育种：是运用遗传学学原理和技术术对某个用于于特定生物技技术目的的菌菌株进行的多多方位的改造造。通过改造造，可使现存存的优良性状状强化，或去去除不良性质质或增加新的的性状。工业菌种育种种的方法诱变基因转移基因重组育种过程包括下列3个个步骤：(1)在不影影响菌种活力力的前提下，，有益基因型型的引入。(2)希望基基因型的选出出。(3)改良菌菌种的评价(包括实验规规模和工业生生产规模)。。选择育种方法法时综合考虑虑的因素(1)待改良良性状的本质质及与发酵工工艺的关系(如批式或连连续发酵试验验)；(2)对这一一特定菌种的的遗传和生物物化学万面认认识的明了程程度；(3)经济费费用。如果对特定菌菌种的基本性性状及其工艺艺知晓甚少，，则多半采用用随机诱变、、筛选及选育育等技术：如果对其遗传传及生物化学学方面的性状状已有较深的的认识，则可可选择基因重重组等手段进进行定向育种种。工业菌种改良良方法(1)解除或或绕过代谢途途径中的限速速步骤：通过过增加特定基基因的拷贝数数或增加相应应基因的表达达能力来提高高限速酶的含含量；在代谢谢裔途径中引引伸出新的代代谢步骤，由由此提供一个个旁路代谢途途径。(2)增加前前体物的浓度度。(3)改变代代谢途径，减减少无用副产产品的生成以以及提高菌种种对高浓度的的有潜在毒性性的底物、前前体或产品的的耐受力。(4)抑制或或消除产品分分解酶。(5)改进菌菌种外泌产品品的能力。(6)消除代代谢产品的反反馈抑制。如如诱导代谢产产品的结构类类似物抗性。。提高特定基因因的表达水平平(1)引入强强转录及翻译译信号，可通通过在一高效效表达载体上上克隆靶基因因；在靶基因因的上游引入入强启动子；；修改现有表表达信号，提提高基因效力力等。(2)诱导解解除基因表达达抑制的突变变。改进菌种的生生长效率提高菌株对底底物的利用率率方法：a.通过过确定并改变变代谢中的耗耗能部分;b.由另一一菌株的高效效低能代谢途途径代谢来实实现。c.赋予菌菌种对多种底底物，特别是是价廉而丰富富的底物的利利用能力，由由此可降低操操作费用。第四节诱诱变育种以微生物的自自然变异作为为基础的生产产选种的机率率并不很高，，一个基因的的自然突变频频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以以诱发突变为为基础的育种种，是迄今为为止国内外提提高菌种产量量、性能的主主要手段。诱变物理、化学或或生物诱变方方法一、诱变剂和和诱变处理物理诱变剂：：射线如紫外外线、X—射射线、γ—射射线，快中子子；物理因素中目目前使用得最最方便而且十十分有效的是是紫外线。许许多高产菌株株的选育都用用过紫外线，，对于一般实实验室、中小小型工厂都适适用，也很安安全。其他的几种射射线都是电离离性质的，有有一定的穿透透力，一般都都由专业人员员在专门的设设备中使用，，否则有一定定危险性。超净工作台小型X射线衍衍射仪Co60射线线机化学诱变剂：：化学因子如碱碱基类似物、、5—氟尿嘧嘧啶、烷化剂剂等。化学诱变剂中中使用最多、、最有效的是是烷化剂。使用化学诱变变剂的优缺点点：1、大多数情情况下，就突突变数量而言言，要比电离离辐射更有效效。2、化学诱变变剂是很经济济的，因为只只需要少量的的合适的诱变变剂，设备是是实验室的一一般玻璃器皿皿，一个蒸气气罩。而用电电离辐射±行行工作时，设设备费用大，，并要注意安安全性。3、大部分诱诱变剂是致癌癌剂，所以在在使用中必须须非常谨慎，，要避免化学学诱变剂与皮皮肤接触，，，且切勿吸入入其蒸气，有有人对某些诱诱变剂极其敏敏感，甚至未未直接接触就就会过敏，这这就更要当心心。诱变剂的选择择1．碱基类似似物和羟胺具具有很高的特特异性，但很很少使用，回回复突变率高高，效果不大大。2．亚硝酸和和烷化剂应用用的范围较广广，造成的遗遗传损伤较多多。其中亚硝基胍和和甲基磺酸乙乙酯常被称为“超超诱变剂”，，甲基磺酸乙乙酯是毒性最最小的诱变剂剂之一。3．吖啶类诱诱变剂可以造造成生化代谢谢途径的完全全中断。4．紫外线仍仍十分有效。。电离辐射是是造成染色体体巨大损伤的的最好诱变剂剂，它能造成成不可回复的的缺突变。但但它可能影响响邻近基因的的性能。二、诱变育种种步骤出发菌株的选选择处理菌悬液的的制备诱变处理中间培养分离和筛选(一)出发菌菌株的选择1．自然界新新分离的野生生型菌株，对对诱变处理较较敏感，容易易达到好的效效果。2．在生产中中经生产选种种得到的菌株株与野生型较较相像，也是是良好的出发发菌株。3．每次诱变变处理都有一一定提高的菌菌株，往往多多次诱变能积积累较多的提提高。4．出发菌株株开始时可以以同时选2～～3株，在处处理比较后，，将更适合的的出发菌株留留作继续诱变变。5．要尽量选选择单倍体细细胞、单核或或核少的多细细胞体来作出出发诱变细胞胞，这是由于于变异性状大大部分是隐性性的，特别是是高产基因。。6．根据采用用的诱变剂或或根据细胞生生理状态或诱诱变谱选择诱诱变剂，因为为同一诱变剂剂的重复处理理会使细胞产产生抗性，使使诱变效果下下降。有的诱诱变剂是作用用于营养细胞胞，就要选对对数期的细胞胞：有的作用用于休止期，，就可选用孢孢子。(二)处理菌菌悬液的制备备这一步骤的关关键是制备单单细胞和单孢孢子状态的、、活力类似的的菌悬液，为为此要进行合合适培养基的的培养，并要要离心，洗涤涤，过滤。带玻璃珠的三角瓶内,加无菌水水(三)诱变处处理根据前面有关关诱变剂及诱诱变处理的介介绍，结合诱诱变对象的实实际，设计诱诱变处理方案案。(四)中间培培养由于在发生了了突变尚未表表现出来之前前，有一个表表现延迟的过过程，即细胞胞内原有酶量量的稀释过程程(生理延迟迟)，需3代代以上的繁殖殖才能将突变变性状表现出出来。此过程程称为中间培培养这个过程对今今后的筛选和和获得稳定菌菌株都是极为为重要的。方法：让变异处理后后细胞在液体体培养基中培培养几小时，，以让细胞的的遗传物质复复制，让细胞胞繁殖几代，，以得到纯的的变异细胞。。若不经液体培培养基的中间间培养，直接接在平皿上分分离就会出现现变异和不变变异细胞同时时存在于一个个菌落内的可可能，形成混混杂菌落，以以致造成筛选选结果的不稳稳定和将来的的菌株退化。。(五)分离和和筛选筛选分初筛和和复筛。初筛筛以迅速筛出出大量的达到到初步要求的的分离菌落为为目的，以量量为主。复筛则是精选选，以质为主主，也就是以以精确度为主主。因此在具具体方法上就就有差异.初筛可以在平平皿上直接以以菌落的代谢谢产物与某些些染料或基质质的作用形成成的变色圈或或透明圈的大大小来挑取参参加复筛者，，而将90%的菌落淘汰汰。在数量减少后后就要仔细比比较参加复筛筛和再复筛的的菌株，最后后才能选得优优秀菌株。在在以后的复筛筛阶段，还应应不断结合自自然分离，纯纯化菌株。摇床复筛降解纤维素产产生产透明圈圈病毒产生产空空斑紫外线的诱变变育种紫外线诱变一一般采用15W紫外线杀杀菌灯，波长长为2537A．灯与处处理物的距离离为15～30cm，照照射时间依菌菌种而异，一一般为几秒至至几十分钟。。一般我们常常以细胞的死死亡率表示，，希望照射的的剂量死亡率率控制在70～80%为为宜。被照射的菌悬悬液细胞数，，细菌为106个/ml左右，霉菌孢孢子和酵母细细胞为106～107个/ml。由于于紫外线穿透透力不强，要要求照射液不不要太深，约约0.5～1.0cm厚厚，同时要用用电磁搅拌器器或手工进行行搅拌，使照照射均匀。由于于紫紫外外线线照照射射后后有有光光复复活活效效应应，，所所以以照照射射时时和和照照射射后后的的处处理理应应在在红红灯灯下下进进行行。。(二二)操操作作步步骤骤1．．将将细细菌菌培培养养液液以以3000r／／min离离心心5min，，倾倾去去上上清清液液，，将将菌菌体体打打散散加加入入无无菌菌生理理盐盐水水再离离心心洗洗涤涤。。2．．将将菌菌悬悬液液放放入入一一已已灭灭菌菌的的，，装装有有玻玻璃璃珠珠的的三三角角瓶瓶内内用用手手摇摇动动，，以以打散散菌菌体体。将将菌菌液液倒倒入入有有定定性性滤滤纸纸的的漏漏斗斗内内过过滤滤，，单单细细胞胞滤滤液液装装入入试试管管内内，，一一般般处处于于浑浑浊浊态态的的细细胞胞液液含含细细胞胞数数可可达达108个／／ml左左右右，，作作为为待待处处理理菌菌悬悬液液。。3．．取取2～～4m1制制备备的的菌菌液液加加到到直直径径9cm培培养养皿皿内内，，放放入入一一无无菌菌磁磁力力搅搅拌拌子子，，然然后后置置磁磁力力搅搅拌拌器器上上、、15W紫紫外外线线下下30cm处处。。在在正正式式照照射射前前，，应应先先开开紫紫外外线线10min，，让让紫紫外外灯灯预预热热，，然然后后开开启启皿皿盖盖正正式式在在搅搅拌拌下下照照射射10～～50s。。操操作作均均应应在在红红灯灯下下进进行行，，或或用用黑黑纸纸包包住住，，避避免免白白炽炽光光。。4．．取取未未照照射射的的制制备备菌菌液液和和照照射射菌菌液液各各0.5ml进进行行稀释释分分离离，计计数数活活菌菌细细胞胞数数。。5．．取取照照射射菌菌液液2ml于于液液体体培培养养基基中中(300ml三三角角瓶瓶内内装装30ml培培养养液液)，，120r／／min振振荡荡培培养养4～～6h。。6．．取取中中间间培培养养液液稀稀释释分分离离、、培培养养。。7．．挑挑取取菌菌落落进进行行筛筛选选。。亚硝硝基基胍胍诱诱变变曲曲霉霉菌菌N——甲甲基基——N'-硝硝基基-N-亚亚硝硝基基胍胍(NGN，，MNNG或或TG)对对真真核核或或原原核核微微生生物物都都有有强强烈烈的的诱诱变变作作用用。。其其精精确确的的作作用用机机制制尚尚不不很很清清楚楚，，据据认认为为是是伴伴随随着着重重氮氮甲甲烷烷的的生生成成及及在在酸酸性性条条件件下下生生成成亚亚硝硝酸酸，，直直接接作作用用于于细细胞胞内内的的DNA复复制制系系统统，，从从而而诱诱发发了了变变异异。。MNNG的的诱诱变变作作用用随随pH的的升升高高而而增增强强。。(二二)操操作作步步骤骤1．．单单孢孢子子悬悬液液制制备备取取斜斜面面，，加加入入6ml0.1mol／／LpH6.o的的磷磷酸酸缓缓冲冲液液，，用用接接种种环环刮刮下下孢孢子子，，振振荡荡试试管管，，立立即即通通过过带带滤滤纸纸漏漏斗斗过过滤滤，，由由此此制制得得单单孢孢子子悬悬液液，，若若孢孢子子液液浑浑浊浊状状，，其其孢孢子子浓浓度度可可达达l06个个／／ml，，此此为为待待处处理理孢孢子子悬悬液液。。2．．MNNG溶溶液液的的制制备备用用分分析析天天平平称称取取2mg，，加加入入2ml0.1mol／／LpH6.0磷磷酸酸缓缓冲冲液液，，于于暗暗处处振振荡荡溶溶解解。。3．．诱诱变变处处理理吸吸取取MNNG溶溶液液lml，，加加入入到到1m1孢孢子子悬悬液液中中，，30℃℃振振荡荡30min，，立立即即稀稀释释1000倍倍停停止止作作用用，，然然后后以以10-2，10-4两个个稀稀释释度度分分离离培培养养，，30℃℃3天天后后计计数数。。4．．死亡亡率率计计算算将未未处处理理的的孢孢子子液液1ml加加入入1ml磷磷酸酸缓缓冲冲液液中中，，同同上上逐逐级级稀稀释释分分离离，，30℃℃下下培培养养3天天。。根根据据处处理理前前后后的的活活孢孢子子数数可可计计算算出出死死亡亡率率。。5．．挑挑取取菌菌落落进进行行糖糖化化酶酶及及蛋蛋白白酶酶产产量量筛筛选选．．第五五节节营营养养缺缺陷陷型型的的选选育育营养养缺缺陷陷型型是是指指通通过过诱诱变变而而产产生生的的缺缺乏乏合合成成某某些些营营养养物物质质如如氨氨基基酸酸、、维维生生素素和和碱碱基基等等的的能能力力，，必必须须在在其其基基本本培培养养基基中中加加入入相相应应的的营营养养成成分分才才能能正正常常生生长长的的变变异异株株。。与营营养养缺缺陷陷型型对对应应的的是是野野生生型型。与筛筛选选营养养缺缺陷陷型型有关关的的三三类类培培养养基基①基基本本培培养养基基（（M．M．，，minimalmedium）————能能满满足足某某一一菌菌种种的的野野生生型型或或原原养养型型菌菌株株营营养养要要求求的的最最低低成成分分的的合合成成培培养养基基。。②补补充充培培养养基基（（S．M．，，supplementalmedium）————在在基基本本培培养养基基中中有有针针对对性性地地补补加加某某一一种种或或几几种种营营养养成成分分，，以以满满足足相相应应的的营养养缺缺陷陷型型菌株株生生长长需需要要（（其其他他营养养缺缺陷陷型型仍不不能能生生长长））的的培培养养基基。。③完完全全培培养养基基（（C．M．，，completemedium）————可可满满足足该该菌菌各各种种营养养缺缺陷陷型型菌株株营营养养需需要要的的天天然然或或半半合合成成培培养养基基。。营养养缺缺陷陷型型的的用用途途营养养缺缺陷陷型型在在生生产产上上和和科科学学研研究究上上用用途途很很大大。。目目前前生生产产氨氨基基酸酸、、核核苷苷酸酸的的菌菌种种都都是是各各种种类类型型的的缺缺陷陷型型。。要要研研究究代代谢谢途途径径，，育育种种技技术术都都必必须须有有营营养养缺缺陷陷型型的的菌菌株株为为材材料料。。筛选选营营养养缺缺陷陷型型的的步步骤骤诱变变淘汰汰野野生生型型检出出缺缺陷陷型型确定定生生长长谱谱一、、诱诱变变方方法法物理理诱诱变变化学学诱诱变变二、、淘淘汰汰野野生生型型抗生生素素法法：：野野生生型型能能在在MM中中生生长长，，而而缺缺陷陷型型不不能能，，于于是是将将诱诱变变处处理理液液在在MM中中培培养养短短时时让让野野生生型型生生长长，，处处于于活活化化阶阶段段，，而缺缺陷陷型型无无法法生生长长，，仍仍处处于于休休眠眠状状态态。由由于于细细菌菌或或酵酵母母对对一一些些抗抗生生素素敏敏感感，，于于是是就就相相应应加加入入一一定定量量的的抗抗生生素素，，结结果果活活化化状状态态的的野野生生型型就就被被杀杀死死，，保保存存了了缺缺陷陷型型。。一一般般细细菌菌可可以以采采用用青青霉霉素素，，酵酵母母可可采采用用制制霉霉菌菌素素。。菌丝丝过过滤滤法法：：对对于于霉霉菌菌，，因因孢孢子子生生长长后后会会长长出出菌菌丝丝体体，，就就可可用用滤滤纸纸过过滤滤法法将将菌菌丝丝滤滤去去，，而而缺缺陷陷型型孢孢子子却却因因未未发发芽芽而而不不能能滤滤过过。。三、、检检出出缺缺陷陷型型原理理：：在在固固体体基基本本培培养养基基和和完完全全培培养养基基上上，，生生长长情情况况完完全全不不同同，，缺缺陷陷型型在在CM上上生生长长良良好好，，而而在在MM上上则则不不生生长长，，野野生生型型都都能能生生长长。。具体体方方法法：：影影印印法法、、点点种种法法、、夹夹层层法法1．．将将一一较较平平皿皿直直径径小小1cm的的金金属属圆圆筒筒蒙蒙上上一一层层灭灭菌菌的的丝丝绒绒，，用用金金属属夹夹夹夹住住，，灭灭菌菌。。2．．将将完完全全培培养养基基上上长长出出的的全全部部菌菌落落在在丝丝绒绒上上轻轻轻轻一一压压，，使使之之成成为为印印模模，，标标记记方方位位。。3．．将将基基本本培培养养基基平平皿皿和和完完全全培培养养基基平平皿皿在在标标记记的的同同一一方方位位上上先先后后轻轻轻轻一一压压，，此此菌菌印印模模即即复复印印于于上上。。(一一)影影印印法法4．．将将CM和和MM在在恒恒温温箱箱中中培培养养。。5．．二二平平皿皿相相同同方方位位进进行行比比较较，，即即可可发发现现在在MM平平皿皿上上长长出出的的菌菌落落少少于于GM平平板板上上的的。。MM上上未未长长而而相相应应于于CM上上长长出出的的那那几几个个菌菌落落就就可可能能是是缺缺陷陷型型。。此法法要要求求平平皿皿上上菌菌落落不不能能太太多多，，菌菌落落之之间间应应有有一一定定间间隔隔。。(二二)点点种种法法也就就是是任任意意法法。。用接接种种针针或或牙牙签签将将CM上上长长出出的的菌菌落落在在MM和和CM两两副副平平板板上上接接种种，，依依次次在在相相应应位位置置点点种种，，然然后后一一起起培培养养，，观观察察其其生生长长情情况况。。此法法结结果果明明确确，，但但工工作作量量大大。。(三三)夹夹层层法法先在在培培养养皿皿上上倒倒一一层层基基本本琼琼脂脂培培养养基基，，凝凝固固后后涂涂上上一一层层含含菌菌的的MM，，凝凝固固后后再再倒倒一一薄薄层层MM琼琼脂脂培培养养基基，，培培养养24h，，将将出出现现的的菌菌落落标标记记，，然然后后倒倒上上一一层层CM琼琼脂脂培培养养基基，，再再培培养养。。这这时时第第二二批批长长出出的的菌菌落落就就可可能能是是缺缺陷陷型型。。此法缺点是是，结果有有时不明确确，而且将将缺陷型菌菌落从夹层层中挑出并并不很容易易。四、营养缺缺陷型生长长谱的确定定验证确定是是缺陷型后后，就需确确定其缺陷陷的因子，，即生长谱谱测定。生长谱测定定的方法将缺陷型菌菌株培养后后，收集菌菌体，制备备成细胞悬悬液，与MM培养基基(融化并并凉至50℃)混合合并倾注平平皿。待凝凝固后，分分别在平皿皿的5～6个区间放放上不同的的营养组合合的混合物物或吸饱此此组合营养养物的滤纸纸圆片。培培养后会在在某组合区区长出，就就可测得所所需营养。。—个平皿皿测一个菌菌。以不同组合合的营养混混合物与融融化凉至50℃的MM培养基基混合铺成成平皿，然然后在这些些平皿上划划线接种各各个缺陷型型菌株于各各相应位置置，培养后后根据在这这些组合长长出可推知知其营养因因子。在5～6个平平皿上可测测20株菌菌以上。第六节基基因育种种基因重组育育种：是运运用体外DNA各种种操作或修修改手法获获得目的基基因，再借借助于病毒毒、细菌质质粒或其他他载体，将将目的基因因转移至新新的宿主细细胞并使其其在新的宿宿主细胞系系统内进行行复制和表表达，或者者通过细胞胞间的相互互作用，使使一个细胞胞的优秀性性状经其间间遗传物质质的交换而而转移给另另—个细胞胞的方法。。一个完整的的基因克隆隆过程包括括以下步骤骤１、获得待待克隆的DNA片段段（基因））；２、目的基基因与载体体在体外连连接；３、重组DNA分子子导入宿主主细胞；４、筛选、、鉴定阳性性重组子；；５、重组子子的扩增与与／或表达达。2.2基因重组一、质粒的的特点1、质粒的的存在并非非微生物生生命活动必必需。2、每个细细胞中存在在的质粒数数称为该质质粒的拷贝贝数。不同同类型的质质粒其拷贝贝数各异，，同一质粒粒在不同条条件下，拷拷贝数也可可能差异很很大，有严严紧型和松松弛型两种种。3、质粒DNA分子子常呈现三三种形态；；常见的一一种是共价价、闭环状状DNA(CCCDNA)；其次是是由于—条条链有缺口口而产生的的开环DNA(ocDNA)；第三种种是由双环环分子两段段均断裂而而产生的线线性DNA。质粒载体二、各类质质粒所赋予予宿主细胞胞的不同表表现型抗生素抗性性：抗生素素的产生；；大肠杆菌菌素的产生生；肠毒素素的产生；；复杂有机机化合物的的降解；限限制性核酸酸内切酶和和修饰酶的的产生；杀杀伤性能。。在自然条件件下，许多多质粒可经经细菌接合合或相似方方式在宿主主间相互转转移。在实实验室条件件下，质粒粒也可经人人工手段将将其转化入入宿主细胞胞内。载体－宿主主系统载体(vector)是携带带外源DNA进入宿宿主细胞进进行扩增和和表达的DNA；一般是通过过改造质粒粒、噬菌体体或病毒等等构建的。。载体应具备备以下条件件：１、能在适适当的宿主主细胞中复复制；２、具有多多种限制酶酶的单一切切点（即所所谓多克隆隆位点）以以便外源DNA插入入；３、具有筛筛选标志以以区别阳性性与阴性重重组分子；；４、载体分分子较小，，以便体外外基因操作作，同时载载体DNA与宿主DNA便于于分离；５、对于表表达型载体体还应具有有与宿主细细胞相适应应的启动子子、增强子子、加尾信信号等基因因表达元件件。宿主细胞必必须符合以以下条件１、对载体体的复制和和扩增没有有严格的限限制；２、不存在在特异的内内切酶体系系降解外源源DNA；；３、在重组组DNA增增殖过程中中，不会对对它进行修修饰；４、重组缺缺陷型，不不会产生体体内重组；；５、容易导导入重组DNA分子子；６、符合重重组DNA操作的安安全标准。。目的基因的的获取一、通过建建立基因文文库分离靶靶基因基因文库包包括两类：：基因组文文库：利用用限制性内内切酶。cDNA：：用mRNA反转录录成单链DNA，再再经DNA聚合酶的的作用产生生双链DNA。可去去除真核生生物基因中中不表达的的内含子。。二、化学合合成法制备备DNA片片段从蛋白质肽肽链的氨基基酸顺序可可以知道它它的遗传密密码，再依依照密码合合成基因。。三、聚合酶酶链反应法法扩增基因因片段对于已知全全部或部分分核苷酸序序列的基因因，可以通通过聚合酶酶链反应（（ＰＣＲ）），以基因因组DNA或cDNA模板扩扩增得到目目的基因片片段。PCR技术术根据需扩增增片段的两两端设计引引物。使DNA解解链（高温温），引物物结合于基基因的两端端（低温）），在合适适温度下开开始合成（（链延长））反应。特点：需要要很少的DNA模板板，且能直直接从基因因组中得到到目的基因因。DNA扩增增PCR反应应DNA片断的克隆隆载体的条件件：a复制起点b适宜的的限制酶切切点c选择标标记DNA分子子的体外连连接DNA片段段的体外连连接是重组组DNA技技术的关键键。DNA连接是由由DNA连连接酶催化化完成的。。一、DNA连接酶DNA连接接酶催化两两条双链DNA片段段相邻的5’-磷酸酸和3’-羟基间形形成磷酸二二酯键。在分子克隆隆中最有用用的的DNA连接酶酶是来自ＴＴ４噬菌体体的DNA连接酶酶。T4DNA连接酶酶在分子克克隆中主要要用于：１、连接具具有同源互互补粘性末末端的ＤＮＮＡ片段；；２、连接双双链DNA分子间的的平端；３、在双链链平端的DNA分子子上添加合合成的人工工接头或适适配子。重组DNA导入宿主主菌体外连接的的重组DNA分子必必须导入适适当的受体体细胞中才才能大量的的复制、增增殖和表达达。根据所所采用的载载体的性质质，将重组组DNA分分子导入受受体可有不不同的方法法。一、转化化指以细菌质质粒为载体体，将外源源基因导入入受体细胞胞的过程。。转化时，，细菌必须须经过适当当的处理使使之处于感感受态－即即容易接受受外源DNA的状态态，然后利利用短暂热热休克使DNA导入入细菌宿主主中。此外还可用用电穿孔法法转化细菌菌，它的优优点是操作作简便、转转化效率高高、适用于于任何菌株株。二、转染和和感染利用噬菌体体DNA作作为载体时时可经两种种方式导入入受体菌。。一种是感感染，即在在体外将噬噬菌体DNA包装成成病毒颗粒粒，然后使使其感染受受体菌。另另一种方式式是转染，，即在DNA连接酶酶作用下使使噬菌体DNA环化化，再象重重组质粒一一样地转化化进受体菌菌。但习惯惯上常把以以噬菌体DNA为载载体构建成成的重组子子导入细胞胞的过程统统称为转染染。重组克隆的的筛选与鉴鉴定基因克隆的的最后一步步是从转化化细菌菌落落中筛选出出含有阳性性重组子的的菌落，并并鉴定重组组子的正确确性。通过细菌培培养以及重重组子的扩扩增，获得得所需的基基因片段的的大量拷贝贝。进一步步研究该基基因的结构构、功能，，或表达该该基因的产产物。一、抗药性性标志的筛筛选如果克隆载载体带有某某种抗药性性标志基因因如ampr或tetrr，，转化后后只有含这这种抗药基基因的转化化子细菌才才能在含该该抗菌素的的平板上幸幸存并形成成菌落，这这样就可将将转化菌与与非转化菌菌区别开来来。如果重重组DNA时将外源源基因插入入标志基因因内，该标标志基因失失活，通过过有无抗菌菌素培养基基对比培养养，还可区区分单纯载载体或重组组载体（含含外源基因因）的转化化菌落。二、β－半半乳糖苷酶酶系统筛选选很多载体都都携带一段段细菌的lacZ基基因，它编编码β－半半乳糖苷酶酶N-端的的146个个氨基酸，，称为α－－肽，它表表达β－半半乳糖苷酶酶的C-端端肽链。当载体与宿宿主细胞同同时表达两两个片段时时，宿主细细胞才有ββ－半乳糖糖苷酶活性性，使特异异的底物X-gal变为兰兰色化合物物，这就是是所谓的αα－互补。。而重组子由由于基因插插入使α－－肽基因失失活，不能能形成α－－互补，在在含X-gal的平平板上，含含阳性重组组子的细菌菌为无色菌菌落或噬菌菌斑。三、菌落快快速裂解鉴鉴定法从平板上直直接挑选菌菌落裂解后后，直接电电泳检测载载体质粒大大小，判断断有无插入入片段存在在，该法适适于插入片片段较大的的重组子初初筛。四、内切酶酶图谱鉴定定经初筛鉴定定有重组子子的菌落，，小量培养养后，再分分离出重组组质粒或重重组噬菌体体DNA，，用相应的的内切酶切切割，释放放出插入片片断；对于于可能存在在双向插入入的重组子子，还要用用内切酶消消化鉴定插插入的方向向。重组DNA的鉴定遗传学方法法第七节原原生质体体育种原生质体育育种技术主主要有原生生质体融合合、原生质质体转化技技术，此外外尚有原生生质体诱变变育种等。。原生质休融融合育种是是基因重组组的一种重重要方法。。原生质体融融合作为一一种新的基基因重组手手段是1978年第第三届国际际工业微生生物遗传学学讨论会上上提出来的的。一、原生质质体融合育育种的特点点(一)杂交交频率较高高：细胞壁壁去除后在在高渗条件件下形成类类似于球形形的原生质质体。(二)受接接合型或致致育型的限限制较小：：二亲株中中任何一株株都可能起起受体或供供体的作用用，因此有有利于不同同种属间微微生物的杂杂交。(三)遗传传物质传递递更为完整整：原生质质体融合是是二亲株的的细胞质和和细胞核进进行类似的的合二为一一的过程。。(四)存在在着两株以以上亲株同同时参与融融合形成融融合子的可可能性。（五有可能能采用产量量性状较高高的菌株作作融合亲株株。(六)提高高菌株产量量的潜力较较大。(七)有助助于建立工工业微生物物转化体系系。二、原生质质体融合育育种步骤1．标记菌菌株的筛选选和稳定性性验证。2．原生质质体制备。。3．等量原原生质体加加聚乙二醇醇促进融合合。4．涂布于于再生培养养基，再生生出菌落。。5．选择性性培养基上上划线生长长，分离验验证，挑取取融合子进进一步试验验、保藏。。6．生产性性能筛选。。三、原生质质体融合育育种的要点点（一）标记记菌种的选选择获得标记菌菌种的方法法是采用常常规诱变育育种，筛选选出营养缺缺陷型或／／和抗药性性菌株。这这里最重要要的是标记记必须稳定定。采用抗药药性菌株株除可作作标记外外，在实实验室中中还可排排除杂菌菌污染的的干扰。。为的是是确证融融合的成成功，可可以采用用多标记记菌种。。(二)原原生质体体的制备备原生质体体的制备备主要是是在高渗渗压溶液液中加入入细胞壁壁分解酶酶，将细细胞壁分分离剥离离，结果果剩下由由原生质质膜包住住的类似似球状的的细胞，，它保持持原细胞胞的一切切活性。。在放线菌菌和细菌菌中，制制备原生生质体主主要采用用溶菌酶酶；酵母母和霉菌菌一般可可用蜗牛牛酶或纤纤维素酶酶等。影响原生生质体制制备的因因素1．菌体体的前处处理为了使酶酶作用的的效果好好一些，，可将菌菌作一些些前处理理。如细细菌加入入亚抑制制剂量的的青霉素素。2．菌体体的培养养时间为了使细细胞易于于原生质质体化，，一般选选择增殖殖期的菌菌体。3．酶酶浓度对于不同同种属的的微生物物，不仅仅对酶的的种类要要求不同同，就是是对酶的的浓度也也有差异异。另外外，最佳佳酶浓度度还随不不同的生生长期的的菌体而而变化。。4．酶处处理温度度5．破壁壁时的pH值6．渗透透压稳定定剂等渗透压压在原生生质体制制备中，，不仅起起到保护护原生质质体免于于膨裂，，而且还还有助于于酶和底底物的结结合，渗渗透压稳稳定剂多多采用甘甘露醇，，山梨醇醇，蔗糖糖等有机机物和KCl和和NaCl等无无机物。。第八节筛筛选新新的代谢谢产物一、开发发新的代代谢产物物的途径径(1)从从自然界界分离新新的微生生物菌株株，或采采用新的的检阅方方法筛选选新的代代谢产物物。(2)对对已知微微生物的的代谢产产物进行行化学修修饰。(3)利利用微生生物转化化改造代代谢产物物的结构构。(4)通过过原生质质体融合合获得新新的代谢谢产物。。(5)DNA重重组技术术。二、筛选选微生物物新的代代谢产物物

的程程序突变型菌菌株的筛筛选一、产量量性状突突变株的的筛选三、筛选选微生物物代谢产产物的目目标筛选克服服抗生素素抗性菌菌株的活活性物质质；筛选抗肿肿瘤、抗抗病毒的的活性物物质；研究有药药理活性性的酶抑抑制剂及及免疫调调节剂；；寻找食品品工业最最好的酵酵母培养养物；筛选降解解有害物物质的微微生物以以及治疗疗上具有有低毒、、长效的的化学药药物等。四、筛选选微生物物代谢产产物的方方法(一)直直接方法法为了尽快快确定微微生物代代谢产物物的利用用前途，，在体外外试验测测得活性性后，可可以将培培养液的的有效成成分直接接作用于于机体，，观察被被测样品品的疗效效。这种直接接确定代代谢产物物用途的的方法亦亦称动物物体内治治疗试验验。(二)间间接方法法筛选医用用抗生素素，可用用细茵、、真菌、、病毒或或肿瘤模模型，寻寻找抗细细菌、抗抗真菌、、抗病毒毒、抗肿肿瘤抗生生素、酶酶抑制剂剂、免疫疫制剂等等有效物物质。在预筛选选时，多多用琼脂脂平扳扩扩散抑菌菌法。通通过预筛筛选，直直接测定定最初分分离物的的生物活活性，能能加速筛筛选过程程。五、检测测系统筛选过程程的成功功依赖于于排除那那些已知知的或并并非需要要的代谢谢产物的的检验方方法，这这样才能能识别出出人们需需要的化化合物。。性能签别别性能鉴别别是分离离和筛选选微生物物代谢产产物中最最基础的的工作。。鉴别可分分为两方方面：一是对微微生物方方面进行行形态、、培养、、生化功功能答试试验观察察，并确确定微生生物产生生菌的类类群；二是从化化学的早早期鉴别别来鉴别别微生物物的