本科毕业论文-辽育白牛肌肉生长发育标记基因MSTN靶向MicroRNA鉴定

学号：毕业论文（2014届本科）题目：辽育白牛肌肉生长发育标记基因MSTN靶向MicroRNA鉴定学院：畜牧兽医学院专业：动物科学姓名：指导教师：完成日期：2014年6月12日目录摘要 摘要为了研究辽育白牛肌肉生长发育标记基因MSTN靶向MicroRNA鉴定，本试验通过对辽育白牛DNA的提取睾丸组织DNA提取、DNA浓度和纯度的检测、引物设计以及测序结果，试验结果表明利用在线软件查找牛的miRNA，牛的靶标miRNA库包含687个相关miRNA，用MicroInspector软件将MSTN基因与牛的miRNA结合情况分析后发现MSTN基因的3′-UTR可以结合5个miRNA（图25）。发生突变后结合的miRNA的情况没有发生变化，分别在+5819bp位与bta-miR-2451MIMAT结合，分别在+5222bp位与bta-miR-210MIMAT0结合，在+5136bp位与bta-miR-769MIMAT0结合，在+5609bp位与bta-miR-2288MIMAT结合，在+5187bp位与bta-miR-27a-5pMIM结合，结合的自由能几乎相近，其中bta-miR-2451MIMAT的结合自由能最高为-21.4，所有与MSTN结合的5个miRNA的碱基序列以及在MSTN基因上对应的靶标序列和结合自由能见表详情见表7。发生SNPs后MSTN基因的miRNA结合情况没有发生改变，可见+5304bp位点A到C的突变，+5378bp位点C到G的突变，+5387bp位点位点C到T的突变并没有对MSTN基因与miRNA的结合造成影响，也许并非是功能突变。使用RNAhybrid分析列表中前两个miRNA二级结构，bta-miR-2451序列为5′-augaggugcucuggagagugga-3′，且长度为22bp，其靶标前体长度为32bp，mfe值为-28.2。bta-miR-210序列为5′-acugugcgugugacagcggcuga-3′，且长度为23bp，其靶标前体长度为32bp，mfe值为-24.9。关键词：辽育白牛；DNA；结合；二级结构；MSTN；MicroRNAAbstractInordertostudyLiaoYuwhitecowmusclegrowthanddevelopmentofmarkergenesMSTNMicroRNAtargetingidentified,throughtheextractingofLiaoYuwhitebull'sDNA,testiculartissue'sDNA,thetestingofDNAconcentrationandpurity,eachorganization'stotalRNAextractionandprimerdesigningandsequencing,theresultsshowsthattheusingofonlinesoftwaretofindcattlemiRNA,targetscattlemiRNAlibrarycontains687relatedmiRNA,withtheusingofMicroInspectorsoftware,theMSTNgeneandmiRNAbindingcattleareanalyzed,andfinding3'-UTRMSTNgenecanbecombinedwithfivemiRNA(Figure25).ThesituationafterthemiRNAbindingmutationsdoesnotchange,andeachbitinthe+5819bpbta-miR-2451MIMATbindingwerecombinedwiththebitinthe+5222bpbta-miR-210MIMAT0,andat+5136bpbta-bitmiR-769MIMAT0,bindingbta-miR-2288MIMATat+5609bpposition,MIMcombinationbta-miR-27a-5pinthe+5187bpposition,almostsimilartothefreeenergyofbinding,Whereinbindingbta-miR-2451MIMAThighestfreeenergyof-21.4,andanucleotidesequencecorrespondingtothetargetMSTNgenesequencesofallthecombinationof5MSTNmiRNAbindingfreeenergyasshowninTable7.AftertheoccurrenceofSNPs,MSTNmiRNAgenesdidnotchangethebindingofvisible+5304bplocusmutationAtoC,+5378bpsiteCtoGmutation,+5387bppositionCtoTpointmutationpointdoesnotimpactMSTNgeneandmiRNAbinding,perhapsthisisnotfunctionmutations.WiththeanalysisofthelistusingthefirsttwoRNAhybridmiRNAsecondarystructure,bta-miR-2451sequencecanbefoundtobe5'-augaggugcucuggagagugga-3',thelengthis22bp,thelengthofthetargetprecursoris32bpandmfeis-28.2.Asaresult,bta-miR-210sequenceis5'-acugugcgugugacagcggcuga-3',anditslengthis23bp,thelengthofthetargetprecursoris32bp,mfevalueis-24.9.Keywords：LiaoYuwhitecow;DNA;Binding;Secondarystructure;MSTN;MicroRNA前言辽育白牛以夏洛莱牛为父本、辽宁本地黄牛为母本，从1974年开始进行级进杂交而育成。在辽育白牛核心群母牛中，按照等级评定标准衡量，特级母牛占21.4%，一级母牛70.7%。辽育白牛全身被毛，毛色一致，呈白色或草白色，鼻镜肉色，蹄角多为腊色。体型大，体质结实，肌肉丰满，体躯呈长方形。头宽且稍短，额阔唇宽，耳中等偏大，大多有角，少数无角。颈粗短，母牛平直，颈部和胸部多有垂皮；公牛颈部隆起，无肩峰，垂皮发达。胸深宽、肋圆，背腰宽厚、平直，尻部宽长，臀端宽齐。肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN),又称GDF-8(growthdifferentiationfactor8),是控制肌肉生长的负调控因子,也是近些年研究发现的又一影响畜禽瘦肉率、改善肉质性状的重要营养基因。它通过抑制MyoD家族成员转录活性负向调控肌细胞的生长发育,它的表达量与肌肉重量的变化呈负相关。MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于sirna(双链)但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA(miRNAs)参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。1.MSTN概况肌肉生长抑制素（简称MSTN）又称GDF-8，是TGF-β（transforminggrowthfactorbeta，转化生长因子β）超家族的成员之一。MSTN在骨骼肌中广泛表达，是功能比较专一的肌肉发育负调控因子，在控制骨骼肌生长发育与分化上起着非常重要的作用。MSTN基因实现对肌细胞生长发育的负向调控，是通过抑制成肌细胞的分化抗体家族成员的转录活性来实现的，肌肉重量大小的变化表现为与MSTN基因的表达量呈显著的负相关性（McPherron等，1997）。已有最新报道表明，在不同的家畜动物中，可以使MSTN基因失活，从而导致肌肉增大重量增加现象（McPherron和Lee，2002）。肌肉生长抑制素基因的研究一直是近年来国内外分子遗传领域的研究热点之一，并已取得显著成果。2.MSTN基因研究进展2.1MSTN基因的发现双肌牛最早是由英国人在1774年发现的，由于这类牛具有如下典型特征：全身肌肉膨大，尤其是前躯肌肉发达，肌间沟和肌肉块边缘比较明显，屠体等级高，与普通牛相比，皮薄且皮下脂肪少，瘦肉量多且优质高价肉比例很大，所以在过去的几十年里人们开始对双肌牛的生长及发育、激素调节水平、遗传机制特性和肉质品质等方面都进行了大量的研究（McPherron和Lee，1997；Arthur，1997）。1997年，McPherron等（1997）通过筛选小鼠的骨骼肌cDNA文库寻找新的转化和生长因子时，得到了全长的cDNA序列，发现了一种与TGF-β超家族有共同结构特征的新的生长因子，但是这种基因所编码的蛋白质和TGF-β超家族成员的同源性却不是很高，所以将其划分为一类新的生长因子称为生长分化因子-8（GDF-8）。进一步研究，通过基因敲除技术使该基因的生物活性区缺失而成功培育出缺失MSTN纯合体转基因小鼠，它可以存活并正常生育，小鼠的其他器官组织都无显著差异，但其体重要比野生型和杂合型小鼠重30%（Welle等，2007）。根据该基因具有抑制肌肉发育的表达特异性，则命名为肌肉生长抑制素基因（姜运良等，2000）。后来陆续的在双肌牛﹑双肌羊﹑双肌猪等多种动物中都发现了该基因的突变，甚至还有报道德国一名儿童体内MSTN基因发生突变而导致肌肉发育异常发达（Chuelke等，2004）。通过许多研究发现MSTN基因普遍存在于各种饲养动物中，因此该基因的研究受到科学者们的重视。2.2MSTN基因的结构﹑定位与序列测定TGF-β超家族中的成员（除TGF-β4外）都具有相似的结构（Jakowlew，1998）。并经过克隆多种动物的MSTN基因研究分析证明，MSTN基因作为TGF-β超家族中的一员也同样具有该家族的典型特点：①在MSTN编码的蛋白质N-末端有行使分泌信号功能的相同非亲水性氨基酸序列；②在C-末端有保守的蛋白在C-末端有保守的蛋白酶水解位点由四个氨基酸Arg-Ser-Arg-Arg（RSRR，第263-266位）组成；③C-末端通常有9个半胱氨酸形成“半胱氨酸节点”；④C-末端通过形成具有生物学活性二聚体的二硫键发挥其功能（张利媛和岳文斌，2006）。利用微卫星标记对牛基因组图谱扫描，将牛双肌基因限定在2号染色体上的连锁群着丝粒末端。又有研究进一步分析逐渐缩小了目标锁定范围，最后Smith等（1997）从人造酵母染色体中克隆并利用染色体遗传和物理图像分析，将牛的MSTN基因定位于2号染色体接近于着丝粒2q11处。目前，已经确定牛的双肌基因属于常染色体隐性遗传方式，在2号染色体着丝粒处，只由单个基因座来控制（潘林和孙建义，2004）。牛MSTN基因共有3个外显子和两个内含子，第一第二外显子长度分别是506bp和374bp，于poly（A）尾巴位点的不同所以第3外显子的长度有所波动，出现的核苷酸个数有分别有1701bp，1812bp或1887bp。而两个内含子长度则分别是1840bp和2033bp（孟祥人等，2007）。通过微卫星标记进行连锁分析研究双肌绵羊的遗传时，发现在绵羊2号染色体2远端区有一个数量性状位点能够对肌肉的发育产生效应，MSTN基因很可能就在这个位点。刘铮铸（2006）扩增出了含有完整编码区的山羊MSTN基因DNA序列，同样也含有三个外显子两个内含子，三个外显子长度是：373bp、374bp、381bp；两个内含子长度是1834bp、2027bp。欧阳红生等（2001）运用XbaICassette扩增出猪MSTN基因的全部序列6015bp，3个外显子和2个内含子，外显子为373bp、374bp和381bp，内含子为1809bp，1978bp，并且在起始密码子的上游处找到了CAAT盒、Pit1、NF21、TATA盒等调控元件。MSTN基因在不同物种间是十分保守的：甚至小鼠、大鼠、人、猪、鸡和火鸡在C-端的同源性能达到100%，而牛羊相比只有1-3个碱基的差别，斑马鱼与其他动物比同源性最差也能达到88%（Jiang等，2004）。2.3MSTN基因的表达随着动物发育时期的变化和物种的不同，MSTN基因的表达也呈现一定差异。MSTN在哺乳动物中无论是胚胎发育时期还是成年个体骨骼肌中均有表达。在牛胚胎中，在第15天到第29天之间都能检测到少量MSTN基因的mRNA存在，但在第31天后mRNA的量出现逐渐增加趋势。Kim（2001）等分析了新生牛中MSTN基因的表达，在出生后1天时在半腱肌和股二头肌中MSTN基因表达量最高，到第8天和第14天后表达量逐渐降低。对于排肠肌MSTN基因在出生后第14天表达水平达到最高，第8天后则降到最低。MSTN基因不仅在骨骼肌表达，后来还发现在其他组织中也有不同程度的表达。Sharma等（2001）研究在其他组织器官中MSTN蛋白的分布情况时，发现牛和绵羊心肌组织中该基因也表达。Ji等（1998）发现，除骨骼肌外，在猪的心、肝、肺、肾、脑、舌、骨髓、小肠、乳腺和脂肪组织中也都有表达。Radaelli等（2003）对鱼类的研究发现，MSTN基因在鱼类的多个组织中都有广泛的表达，也说明，MSTN在鱼类体内的生物学功能体现在各个组织当中，而并不仅仅局限于肌肉。对于鸡的MSTN基因研究发现，在发育7天的胚胎胸肌、腿肌和心肌中就能检测到MSTN蛋白，但在肝、脾、肾、肠、肺、脑、皮肤等组织中却没有发现（张宇光等，2006）。2.4MSTN基因应用前景MSTN基因能够通过调控作用实现抑制动物肌肉生长的作用。MSTN基因缺失可以减少脂肪的累积，这一现象是由于MSTN对脂肪细胞的直接作用还是通过对肌肉的作用间接行使功能，具体机制还不是很清楚。通过RNA抑制剂可以干扰MSTN基因的mRNA的表达从而使MSTN基因失去对肌肉细胞生长的抑制作用，敲除MSTN基因可以获得相应双肌动物，这个品种瘦肉率、饲料利用率及肉质品质都很高，尽管也有些不足，如双肌公牛自然交配困难、母牛受胎率低等，但其优点显著，另外在人工授精的帮助下将这种动物引入生产，在畜牧业和肉食工业都有广阔前景。3.MicroRNA概况MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于sirna(双链)但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA(miRNAs)参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。3.1MicroRNA的特征与功能MicroRNA是一类进化上高度保守的非编码的单链内源性小分子RNA，长度范围在16~29个核苷酸，平均长度约为22个核苷酸（陈五军等，2011）。目前，大约有3000种MicroRNA已经被鉴定出来（Griffiths-Jones等，2006）。根据研究推测，三分之一的哺乳动物基因需要MicroRNA调节，而且在转录后水平调控基因表达中，MicroRNA起着重要的作用。MicroRNA并不能通过直接转录形成，而需要信使RNA转录的内含子或内源性的独立转录单位形成（Lee等，2009）。通过结合目标基因的3′-UTR，在转录后抑制蛋白质翻译调节基因或水平降解靶标mRNA的表达，可以实现MicroRNA的调节机制（马继政和张爱军，2010）。在很多动物生长发育过程中，诸如细胞增殖、分化、凋亡等，MicroRNA发挥着重要的调节作用。例如在哺乳动物中，MicroRNA参与了蛋白编码基因活性方面的50%调控（Baetel，2004）。目前的研究表明，在生命活动一系列的重要过程中，MicroRNA也有参与，包括早期发育、细胞增殖、脂肪代谢等。MicroRNA的表达机制很复杂，但最近研究发现其具有一定的组织特异性。MicroRNA的表达可以被肌肉特异性转录因子控制，相关的MicroRNA能通过抑制和翻译靶mRNA的降解来调节转录后基因的表达。目前，已经被证实，在肌肉发育和肌肉细胞增殖和分化过程中MicroRNA具有重要的调节作用（张海军和柴家科，2013）。3.2MicroRNA在肌肉生长发育中的作用遗传研究表明，肌肉发育和功能表达必需MicroRNA的参与。研究发现，在C2C12成肌细胞诱导过程，和分化成肌管细胞期间，骨骼肌MicroRNA中的miR-1、miR-133和miR-206的表达显著上调。分析表明，骨骼肌MicroRNA中的miR-1和miR-206表达上调可以增强肌肉生成，而miR-133表达上调可以调控成肌细胞的分化，从而使成肌细胞增殖得到促进（马继政和张爱军，2010）。miR-1也具有促进肌细胞的分化的作用，在C2C12成肌细胞诱导过程，通过作用于HDAC2家族中的成员HDAC4，miR-1可以发挥促分化作用，而过表达miR-1会促进多核成熟肌管的形成和增加肌源细胞的分化。此过程的原理是：通过一段18个氨基酸的基序，HDAC4可以与所有MEF2发生结合，从而抑制肌细胞的分化。对于C2C12成肌细胞中的miR-133，通过调控血清应答因子、GATA结合蛋白、肌肉增强子、转录因子5等的表达，可以抑制成肌细胞的分化进而促进肌细胞的增殖。研究结果表明，成肌细胞的增殖可以通过抑制内源性的miR-133得到抑制（Nielsen等，2010）。对于MicroRNA中的miR-206，其作用是可以通过降低缝隙连接蛋白的表达量，从而抑制肌细胞的分化，并促进神经肌肉接头的形成（丁伟超等，2012）。通过ChIP技术分析发现，在miR-206上游0.8kb处存在转化生长因子和肌肉生长抑制素的结合位点（Rao，2006），miR-206的表达可以被这两个结合位点抑制，从而达到调控肌肉分化的目的。miR-206的表达的调控同时受到上游肌相关转录因子的影响，在骨骼肌组织中，这种影响维持了miR-206表达的特异性（马国达等，2012）。除此之外，研究人员还发现miR-206和miR-486两种小RNA分子可以影响肌细胞的分化，在这个过程中miR-206和miR-486可以直接与Pax-7基因3′-UTR结合，从而调Pax-7的表达，进而调控肌细胞的合成，影响肌肉发育（王丽娟等，2012）。另外，在C2C12细胞分化过程中，miR-24的表达也会增加。在smad3结合位点以及smad3和miR-24启动子共同参与下，miR-24的表达会受TGF-β1抑制。通过实验发现，转染能抑制miR-24的反义寡核苷酸后，肌细胞分化基因的表达明显减少。在异位表达miR-24后，动物肌细胞的分化功能得到加强，并且在这个过程中，TGF-β1引起的分化抑制可以被miR-24部分逆转（李粉和陈华群，2012）。4.本文研究目的与意义研究与辽育白牛肌肉生长相关MSTN基因，寻找参与MSTN基因表达调控的潜在靶microRNA，可为进一步开展辽育白牛该基因及其与生长发育和肉品性状的相关分析，进行辽育白牛分子育种技术研究等提供理论基础。1试验材料与方法1.1试验动物与来源试验所需的组织样和血样取自辽宁省畜牧管理站所提供的辽育白牛。采集10头种公牛的血液保存于加入ACD的血液抗凝管中，存于-70℃冰箱中保存，用于DNA的抽提。1.1.1血液样品试验以辽宁省培育的新品种——辽育白牛为研究对象进行多次采样分析。样品分别由辽宁省畜牧经理管理站联系大连雪龙集团公司与辽宁绿源肉业有限公司提供。样品利用加有抗凝剂EDTAK2的采集管静脉采血，将采集的样品低温保存，带回实验室-70℃冰箱中保存备用。1.1.2肌肉组织样品在辽宁绿源肉业有限公司所属的屠宰场采集辽育白牛肌肉组织，用提前经过灭菌的镊子和手术刀片分别取100g并切成小块分装，装在纱布袋里，拴好并在绳上粘上标签，立即放入液氮罐中冷冻备用。1.2试验所需药品和试剂DEPC：购自沈阳宝泰克有限公司无水乙醇：沈阳农业大学设备科提供。95%乙醇：沈阳农业大学设备科提供。新洁尔灭：沈阳农业大学设备科提供。DL2000DNAMarker：购自大连宝生物工程有限公司。RNA提取试剂盒：购自天根生化科技有限公司。血液DNA提取试剂盒：购自天根生化科技有限公司。RT-PCR试剂盒Ver3.0：购自大连宝生物工程有限公司。PCR试剂2×TaqPCRMasterMix：购自天根生化科技有限公司。TaKaRaLATaq酶：购自大连宝生物工程有限公司。β-Actin抗体：购自CellSignaling公司。30%丙烯酰胺：购自沈阳宝泰克有限公司。4×Tris·cl/SDS（PH8.8）：购自沈阳宝泰克有限公司。过硫酸铵：沈阳农业大学设备科提供。TEMED：购自沈阳宝泰克有限公司。5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液：购自生工生物工程（上海）有限公司。EB：沈阳宝泰克有限公司。1.3主要仪器设备JJ系列高精度电子天平：常熟市双杰测试仪器厂马头牌YP-B，YP-C型系列应变式电子天平：上海光正医疗仪器有限公司ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂HH-6数显恒温电热水浴锅：国华电器有限公司超纯水仪:美国Mlliipore公司液氮罐：四川亚西机器厂微波炉：广东美的集团电热鼓风干燥箱：大和科学株式会社TGL-20M高速台式冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司–80℃超低温冰箱：NUAIR公司TC-512型梯度PCR仪：英国TECHNE公司ChemiDocXRS数码凝胶成像与分析系统：Bio-Rad公司OYY-HZI型、DYY-111一6B型稳压稳流电泳仪:北京六一仪器厂组织匀浆器：涿州市长虹玻璃仪器厂G560E漩涡震荡仪：美国Scientificindastries公司HE-120水平电泳槽：上海天能科技有限公司U-1800紫外分光光度计：HITACHI公司可调式微量移液器:THERMO公司、Eppendorf公司常用手术器械：本校设备处提供。1.4主要试剂的配制(1)电泳缓冲液(lxTBE):称取`Tris5.49、硼酸2.759、EDTA0.3729,加水soml溶解后,加水定容至10Oml,并调整PH值为8.0备用。(2)EDTA贮存液(o.SM,pH8.0):I86.lgEDTA一N贬·ZHZO加入sooml去离子水中,剧烈搅拌,用Na0H调节pH至8.0(约需209NaoH颗粒),定容到IL,高温高压灭菌,4℃保存。(3)DEPC处理水(0.1%):10O0ml去离子水中加入lmlDEPC,剧烈震荡混匀,37℃处理过夜,高压灭菌后,取部分分装成小份(lml/管),一20℃保存;其余用于配制试剂。(4)75%乙醇(DEPC水配制):750ml无水乙醇中加入250mlDEPC处理水,然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。（5）RNA相关的器皿和试剂操作的注意事项凡与RNA操作有关的玻璃器皿经常规洗净后,用0.1%的DEPC浸泡于37℃,处理过夜,高温高压灭均去除DEPC,然后200℃烘烤8h。塑料器材及即pendor暗、Tip头均使用助Rasefree。的一次性制品。所有溶液(除Tris外)均加入DEPC,至终浓度0.1%,37'C处理过夜,然后高温高压灭菌。Tris溶液用处理好的DEPC水配制,配制好后再高压灭菌。1.5DNA的提取1.5.1天根血液试剂盒提取全血基因组（01）向300μL抗凝剂的血液中加入750μL细胞裂解液，颠倒混匀5次。（02）12,000rpm离心1min。倒弃上清，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2min，确保沉淀在管中（此步骤应小心操作，为避免沉淀被倒出，推荐使用尖底离心管）。（03）将1.5μL蛋白酶K加入缓冲液FG中变成混合液，现配现用，最好在1h之内用完。（04）往含有沉淀的离心管中加入步骤3中的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块（注意：当处理多个样品时，加入缓冲液FG和蛋白酶K的混合液后要立刻涡旋混匀，不要等所有的样品加完后再涡旋振荡。通常涡旋混匀5sec就足以混匀沉淀，但是有可能痕量的胶状沉淀难以混匀，此时可再次补加缓冲液FG和蛋白酶K的混合液，并再次涡旋混匀）。（05）65℃水浴10min，期间颠倒混匀数次（注意：随着蛋白的消解，溶液的颜色从红色变成黄绿色）。（06）加入150μL异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA（注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要，应该仔细观察。对于白细胞数目很少的样品，DNA沉淀可能看不到，此时应该至少颠倒离心管20次确保沉淀完全）。（07）12,000rpm离心5min，倒弃上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保沉淀在管中（注意：在极少的情况下沉淀可能会很松弛，所以要缓慢倒上清。如果样品的白细胞数量足够多，可以看到白色的DNA沉淀）。（08）加入150μL70%乙醇，涡旋振荡5sec钟，12,000rpm离心2min，倒弃上清。（09）重复步骤8（10）将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5min，确保沉淀在管中（注意：在极少的情况下沉淀可能会很松弛，所以要缓慢倒上清，将离心管倒置在吸水纸上是为了减少管壁中上清的回流）。（11）空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净，至少5min（注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应如酶切，PCR等试验。但是要避免过分干燥DNA沉淀，因为过于干燥的DNA很难溶解）。（12）加入200μL缓冲液TB，低速涡旋5sec，65℃加热10min-1h溶解DNA，其间轻弹数次助溶（注意：如果DNA没有完全溶解，可室温过夜。如果使用少量的缓冲液TB溶解DNA，孵育时间可能需要延长）。于-20℃保存。1.5.2肌肉组织DNA提取采用常规的酚/氯仿抽提法，参考《分子克隆试验指南》（萨姆布鲁克斯，2003）具体操作依下列步骤进行：每个样品取10mg睾丸组织，用眼科解剖剪尽量剪碎。剪碎的耳组织小心装在1.5mL离心管中，并加入约500µL的STE。向各个1.5mL离心管中加入10µL的蛋白酶K(20mg/mL)，再加入15µL的SDS(20%)充分混匀。消化过夜，55℃水浴，直至除毛发外的耳组织全部消化干净。向离心管中加入等体积的约600µL的Tris饱和酚，摇动混匀15min，然后离心12000rpm，10min。将上层清液取出装入新的离心管中，再加等体积的Tris饱和酚，摇动混匀15min，离心12000rpm，10min。取上层清液，加入500uL氯仿，混匀15min，离心12000rpm，10min。取上层清液，重复步骤7。取上层清液加入2倍体积的无水乙醇（约1mL），摇动至絮状、白色DNA不再增加。取出或挑出DNA或12000rpm，离心10min，使DNA沉于管底。用75%乙醇洗涤DNA，摇动洗涤后，离心12000rpm5~10min。弃去75%的乙醇，自然干燥后（注意：DNA不能太干，否则难溶于TB），闻之无酒精味后加入适量（约200µL）TB溶解，于-20℃保存。1.5.3DNA浓度和纯度的检测（1）制胶：称取1g琼脂糖粉于锥形瓶中，加入100mL的1×TAE，摇匀后放于微波炉中用中火加热2~3min，常温下静置3min后倒在事先插好梳子的制胶板上。30min后，将梳子小心地垂直拔出。将胶置于水平电泳槽中，使电泳液淹没加样孔。备用。（2）琼脂糖凝胶电泳检测：取2µL待检DNA溶液和1μL6×loadingbuffer上样缓冲液混匀，上样于1%的琼脂糖凝胶中，120V电压电泳30min。图1.1琼脂糖凝胶检测DNAFig.1.1ThegeneDNAProductsofliaobaiwhitecattle（3）在凝胶成像仪中观察电泳结果，并拍照保存，以供分析。1.6引物设计在NCBI数据库找到牛MSTN基因序列（登录号为NM_001001525.2），利用Primer5.0引物设计软件，再用软件Oligo6进行引物评估，分别对基因的5′调控区，CDS和3′-UTR设计特异引物，由上海生工合成引物。引物设计基本原则：①设计的引物和模板的碱基序列应紧密互补；②引物设计过程，上游引物和下游引物之间应避免形成稳定的二聚体或是发夹结构；③设计的引物不能形成错配。引物设计注意事项：①引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp；②GC含量40-60％，Tm值>65℃；③引物序列在模板内应当没有较高相似性片段或3个以上的连续碱基，防止错配；④避免引物的3′端使用碱基A；⑤⊿G值不应过大，越相近越好。依据引物设计原则，辽育白牛MSTN基因所用引物表1.1所示：表1.1MSTN基因3′调控区目的片段扩增引物Table1.1Primersfor3′controlregionofPCRproductsofMSTN引物序列产物退火温度方法3M1F:GTAGATCGCTGTGGGTGTR:CCATAGGGAGGAGTGTGA700bp54.2PCR-Sequence3M2F:AGGTCTTCCCCTCAACAAR:CAGCCATTCAGCCTATTG552bp53.4PCR-Sequence3M3F:AGGACATAAAAGCAAAAGR:TACAATGACAGTAAACCA194bp48.5PCR-Sequence1.6.1辽育白牛MSTN基因引物为I-5-1片段的PCR扩增（1）使用TaKaRaTaq酶试剂盒在冰盒上配置I-5-1片段反应液TaKaRaTaq0.5μl10xPCRBuffer5μldNTPMixture8μl上游引物I-5-1-F1μl下游引物I-5-1-R1μlDNA模板1μlddH2O33.5μl总体积50μl（2）PCR反应程序94℃3min94℃30s47℃30s30cycles72℃2min72℃5min电泳检测PCR产物如图1.2所示。图1.2电泳检测PCR产物FigPCR反应条件的优化在PCR反应过程中，通常在在保证模板DNA质量的前提下，分别对退火温度和镁离子浓度设定一系列梯度进行分析。通过对不同组合条件下得到的PCR产物条带的比较，来确定最佳反应条件组合。如果反复调整PCR退火温度和镁离子浓度后，PCR结果还不能达到理想效果，可再微调模板DNA或Taq酶的用量，直至找到最适PCR反应条件。1.6.3PCR反应体系建立本实验针对RNA基因位点，建立20μL的基本PCR反应体系。MSTN基因引物5MSTN2，5MSTN3、3MSTN1、3MSTN2、3MSTN3的PCR总反应体系包括：2μL10×PCRBuffer（Mg2+）、1.6μL2.5mmol/LdNTPMixture、0.4μL上游和下游引物（20mmoL/L）、0.1μLTaKaRaTaq（5U/μL）、0.4μL模版DNA，最后加15.1μL灭菌超纯水至20μL。PCR运行程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s（需要经过梯度PCR仪设置温度梯度，来寻找各PCR引物最佳退火温度），72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，确定扩增产物为预期目的条带，并特异性良好后，进行后续分析。2结果与分析2.1序列鉴定扩增产物用琼脂糖凝胶电泳法检测，取5L扩增产物与1L加样缓冲液混匀，点样后进行凝胶实验（1%琼脂糖凝胶），同时加5LMarker作参照，在120V电压条件下，电泳20min左右。电泳结束后，凝胶成像仪检测目的条带后拍照，标记，送样到北京华大基因双向测序。测序的结果用DNAMAN4.0生物软件进行拼接，进而得到最终目的序列。将目的序列与GenBank中相应基因序列进行比对分析，从而实现基因的序列结构确定。然后利用DNAStar，DNAMAN4.0，BLAST等软件与GenBank中序列进行比较分析。2.1.1序列分析利用数据库和线软件预测3′端非翻译区序列靶标MicroRNA：①miRBase（/）MicroRNA预测。②MicroInspector（http://bio2server.bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/）、Target（http://bio2server.bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/）和TargetScan（http://www.T/），靶标MicroRNA核心种子区序列结合程度鉴定。③RNAhybrid（http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html）MicroRNA结构分析。2.1.2电泳结果图2.1MSTN基因PCR扩增产物Fig.2.1PCRproductsofMSTNgene2.2测序结果将十头辽育白牛的血样及睾丸组织得到的3’端PCR产物三个样混在一起组成DNA池，以及辽育白牛睾丸组织编码区的PCR产物均交由北京华大基因测序公司进行测序，得到结果。图2.2辽育白牛MSTN基因3′-UTR序列Fig.2.23′-UTRsequenceofMSTNgeneinLiaoyuwhitecattle2.2.1MSTN基因3′-UTR生物信息学特征测序后通过基因序列与波峰的比对发现，在MSTN基因3′-UTR区发现了三个突变位点，分别是+5304bp位点A到C的突变，+5378bp位点C到G的突变，+5387bp位点C到T的突变（图2.3）。图2.3辽育白牛MSTN基因3′-UTR测序Fig.2.3Sequencingof3′-UTRinMSTNgeneofLiaoyuwhitecattle2.2.2MSTN靶标miRNA分析利用在线软件查找牛的miRNA，牛的靶标miRNA库包含687个相关miRNA，用MicroInspector软件将MSTN基因与牛的miRNA结合情况分析后发现MSTN基因的3′-UTR可以结合5个miRNA（图2.4）。发生突变后结合的miRNA的情况没有发生变化，分别在+5819bp位与bta-miR-2451MIMAT结合，分别在+5222bp位与bta-miR-210MIMAT0结合，在+5136bp位与bta-miR-769MIMAT0结合，在+5609bp位与bta-miR-2288MIMAT结合，在+5187bp位与bta-miR-27a-5pMIM结合，结合的自由能几乎相近，其中bta-miR-2451MIMAT的结合自由能最高为-21.4，所有与MSTN结合的5个miRNA的碱基序列以及在MSTN基因上对应的靶标序列和结合自由能见表详情见表2.1。发生SNPs后MSTN基因的miRNA结合情况没有发生改变，可见+5304bp位点A到C的突变，+5378bp位点C到G的突变，+5387bp位点位点C到T的突变并没有对MSTN基因与miRNA的结合造成影响，也许并非是功能突变。图2.4MicroInspector分析辽育白牛MSTN基因靶标miRNA结合情况Fig.2.4MicroinspectoranalysisofmiRNAbindingconditionstargetedbyMSTNgeneinLiaoyuwhitecattle表2.1靶标miRNA的碱基序列Table2.1BasesequenceoftargetmiRNAPOSITIONSEQUENCEOFTARGETNAMEOFMIRNASEQUENCEOFMIRNAFREEENERGY696gaaagaaaactcattctcctagaggtctacatbta-miR-2451MIMATaugaggugcucuggagagugga-21.499tatgctacagtcacttaagcacaagctacagtbta-miR-210MIMAT0acugugcgugugacagcggcuga-20.713gttcatagcttcctcaaacatggaaggtcttcbta-miR-769MIMAT0ugagaccuccggguucugagcu-20.4486aatagggatggcacaccgtacgcaagttaccabta-miR-2288MIMATagguaguaggugugugguuu-20.164tgtgaaattatgtaccacaggctataagcctabta-miR-27a-5pMIMagggcuuagcugcuugugagca-MSTN靶标miRNA结构使用RNAhybrid分析列表中前两个miRNA二级结构，bta-miR-2451序列为5′-augaggugcucuggagagugga-3′，且长度为22bp，其靶标前体长度为32bp，mfe值为-28.2。bta-miR-210序列为5′-acugugcgugugacagcggcuga-3′，且长度为23bp，其靶标前体长度为32bp，mfe值为-24.9，如图2.5所示。图2.5MiRNA-245和MiRNA-210结构Fig.2.5StructureofmiRNA-2451andmiRNA-2103.讨论与结论3.1讨论microRNA是一类长度约22nt的内源性非编码小RNA分子（zhang等，2009），它能够通过与靶基因3′非翻译区结合从而抑制靶基因的翻译或降解靶基因。miRNA参与复杂的生物学过程。microRNA是一组不编码蛋白质自身不具备开放阅读框架的短序列RNA，在真核生物中广泛存在，在进化上具有高度保守性，表达上具备严格的时空性和组织特异性，且在不同生物体间行使相同的功能。最近发现microRNAs在肌肉生长发育中发挥重要的调节作用（huang等，2011）。随着对miRNA的深入研究，已从识别miRNA，阐明作用机制，转移到鉴定其功能。本试验试图通过生物信息分析MSTN基因3′UTR区的相关功能性SNP来筛选不同的miRNA，探讨MSTN基因对于辽育白牛肌肉生长发育的调控新机制。发现辽育白牛MSTN基因3′端潜在的靶miRNA并没有因为出现SNP而发生本质性的变化，可能是因为辽育白牛与NCBI上普通牛的MSTN基因3′端靶标结合区域都极其保守，不容易发生突变，这也意味着，预测得到的潜在靶miRNA即bta-miR-2451MIMAT，bta-miR-210MIMAT0，bta-miR-2288MIMAT，bta-miR-27a-5pMIM，bta-miR-769MIMAT0具有相当稳定且重要的意义，可能参与MSTN基因的表达调控。但其具体作用机制尚不清楚。3.2结论MSTN基因存在肌肉生长发育功能相关的靶miRNAbta-miR-2451MIMAT，bta-miR-210MIMAT0，bta-miR-2288MIMAT，bta-miR-27a-5pMIM，bta-miR-769MIMAT0，且比较保守。参考文献[1]李静，金双勇，王宝东.新农业2010-03-10[2]周光宏.畜产品加工学[M].北京:中国农业出版社,2002.[3]王笑丹，孙永海，胡铁军，等.基于计算机图像分析的肌内脂肪含量测定[J].食品科学，2005（7）：200-204.[4]李志才，易康乐湘西黄牛的H-FABP基因对大理石花纹和肌内脂肪含量[J].中国牛业科学，2010，36（1）：1-4[5]Smith,P.,Casas,E.andRexroad,C.E,2000.BovineCAPN1mapstoaregionofBTA29containingaquantitativetraitlocusofmeattenderness.JAnimSei,78,2589-2594.[6]张菊，2009。绵羊CAST、MC4R和BTG1基因的克隆、组织表达和遗传多态性分析。中国农业科学院硕士学位论文。[7]McPherron,A.C.andLee,S.J.,2002.Suppressionofbodyfataccumulationinmyostatindeficientmice.JournalofClinicalInvestigation,109,595-601.[8]McPherron,A.C.andLee,S.J.,1997.Doublemusclingincattleduetomutationsinthemyostatingene.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,94,12457-12461.[9]孙少华,李雪梅,魏学蕊,师守堃,常泽军,李玉,冯利民.

牛肌肉生长抑制素基因的检测、分型研究(简报)[J].河北农业大学学报.2001(03)[10]李天俊,郑丽萍,段县平.

应用PCR技术从牛肌肉组织中进行性别鉴定[J].天津农学院学报.2001(04[11]甘尚权,刘守仁,王新华,尹君亮,李宁.

HYP