高三生物一轮复习课件：第4节　生物技术在食品加工及其他方面的应用及血红蛋白的提取与分离

第4节生物技术在食品加工及其他方面的应用及血红蛋白的提取与分离

考纲考情1从生物材料中提取某些特定的成分。2蛋白质的提取和分离

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质一、分离蛋白质的原理基础点梳理蛋白质的提取和分离（一）凝胶色谱法（分配色谱法）原理：根据蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。二、分离蛋白质的方法1、原理：利用待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度。（二）凝胶电泳法2、类型：（2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶电泳比较琼脂糖凝胶电泳和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)从载体上看，利用琼脂糖凝胶作为载体的是琼脂糖凝胶电泳，利用SDS—聚丙烯酰胺凝胶作为载体的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。(2)从依据上看，利用了分子带电性质差异和分子大小的是琼脂糖凝胶电泳，仅利用了分子大小的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。(3)从优点上看，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需处理，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了静电荷对迁移率的影响，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。2、缓冲溶液的配制

通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液三、缓冲溶液

在一定的范围内，能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH值的影响，维持pH基本不变1、作用四、实验操作样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定(一)样品处理蛋白质提取和分离步骤:血液组成操作过程：1.红细胞的洗涤①洗涤红细胞目的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化②洗涤操作过程A、采集血样B、低速短时间离心C、吸取血浆：用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆D、生理盐水洗涤：用五倍体积的生理盐水洗涤E、缓慢搅拌10min低速短时间离心F、重复D、E步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净注意事项：要加入柠檬酸钠防止血液凝固；用生理盐水洗涤，可保持红细胞渗透压稳定红细胞洗涤时，洗涤次数，离心速度与时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高或过长会使白细胞一同沉淀，达不到分离的效果。2.血红蛋白的释放

加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（溶解细胞膜加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白3.分离血红蛋白溶液有机溶剂甲苯层无色透明

脂类物质白色薄层固体

血红蛋白溶液红色透明液体红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物用

，除去

，于

中静置片刻后，分出下层的红色透明液体滤纸过滤脂类物质沉淀层分液漏斗

取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时4.透析（粗分离）过程除去样品中分子量较小的杂质②透析目的1.凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端（二）纯化----凝胶色谱法除去相对分子质量较大的蛋白质目的：

底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底注意事项：⑤安装其他附属结构③顶塞的制作打孔安装玻璃管④组装将上述三者按相应位置组装成一个整体2.凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择A、材料“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克B、代表意义：交联葡聚糖凝胶（G-75）配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液②凝胶的前处理③凝胶色谱柱的装填方法A、固定B、装填将色谱柱处置固定在支架上将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀注意：b、装填凝胶柱时不得气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果a、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果

注意：2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时④洗涤平衡3.样品加入与洗脱①调节缓冲液面②滴加透析样品吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐关闭出口③样品渗入凝胶床④洗脱加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口小心加入pH为7的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）⑥注意：正确的加样操作a、不要触及破坏凝胶面b、贴壁加样c、使吸管管口沿管壁环绕移动（三）纯度鉴定：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳方法来鉴定血红蛋白纯度观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。实验结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？植物有效成分的提取胡萝卜素粗品鉴定过程中的5个易错点(1)层析时没有选择干净的滤纸，导致实验现象不明显。为了防止操作时对滤纸的污染，应尽量避免用手直接接触滤纸，可以戴手套进行操作。(2)点样时点样圆点太大(直径大于2mm)，导致最终在滤纸上形成一条线，无法辨认被提取的色素；点样圆点的直径应为2mm。(3)将点好样的滤纸卷成筒状，卷纸时不能将滤纸两边相互接触：以避免由于毛细现象导致溶剂沿滤纸两边的移动加快，溶剂前沿不齐，影响结果。(4)层析液没及样品原点，色素溶解于层析液中，造成实验失败。层析液不可没及样品原点，以免色素溶解于层析液中，使鉴定失败。(5)没设置标准样品作对照：层析液中是否提取到胡萝卜素，可通过与标准样品中的β－胡萝卜素作对比予以确认。植物有效成分提取三种方法比较提取方法水蒸气蒸馏法压榨法有机溶剂萃取法实验原理利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂获得芳香油方法步骤①水蒸气蒸馏②分离油层③除水过滤①石灰水浸泡、漂洗②压榨、过滤、静置③再次过滤①粉碎、干燥②萃取、过滤③浓缩适用范围适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油适用于柑橘芳香油、柠檬芳香油等原料易焦糊芳香油的提取适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中优点简单易行，便于分离生产成本低，易保持原料原有的结构和功能出油率高，易分离局限性水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题分离较为困难，出油率相对较低使用的有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量增加植物有效成分提取量关键措施(1)蒸馏法提取植物芳香油①提取量主要取决于植物材料中芳香油含量。②由于植物芳香油易挥发，因此用水蒸气蒸馏法提取植物芳香油时应选择新