DB34-T 3987-2021 禽白血病病毒细胞培养分离检测技术规程-高清现行

ICS11.22034CCSB4134安 徽 省 地 方 标 准DB34/T3987—2021禽白血病病毒细胞培养分离检测技术规程Technicalregulationsforcellculture,isolationanddetectionofavianleukemiavirus2021-09-032021-09-032021-10-03安徽省市场监督管理局发布DB34/T3987DB34/T3987—2021前 言GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。南县农业农村局、池州市动物疫病预防与控制中心。张丹俊、尹磊、赵瑞宏、胡晓苗、钱昌银、刘华、陈辉、翟银建、江美莲。IIDB34/T3987DB34/T3987—2021DB34/T3987DB34/T3987—2021禽白血病病毒细胞培养分离检测技术规程范围样品的检测等技术内容和要求。本文件适用于禽白血病净化中血浆、精液、蛋清和肛拭子样品中禽白血病病毒的细胞培养分离检测。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T26436 禽白血病诊断技术GB/T36873 原种鸡群禽白血病净化检测规程NY/T680禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验方法3术语和定义3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1禽白血病病毒avianleukosisvirus，ALVALVɑALVA～J10ABCDEJ亚群病毒与鸡的禽白血病相关，可诱发鸡不同组织的良性和恶性肿瘤。A、B、C、D和J亚群属外源性ALV，与禽白血病的不同类型肿瘤发病相关。E亚群病毒为内源性病毒，其致病性很低或没有致病性。3.2DF-1chickenembryofibroblastcelllineDF-1为鸡胚成纤维细胞的自发永生化细胞系。4接种样品的准备1mL1mg/mL1mL0.1mL1mL，或使用含肝素钠抗凝剂的真空采血管采血1～2mL。14.1.2血浆的分离与保存采集的鸡抗凝血样品应保存在4℃环境下，采集的鸡血液样品应尽快处理并接种DF-16r/min2min，备用。应按照GB/T36873中规定的方法进行种公鸡精液的采集。公鸡精液样品的保存与处理采集的公鸡精液样品应保存在4℃环境下，保存期限不超过6h。在无菌的1.5mL的离心管中，加入精液样品40μL，加入精液稀释液160μL，振荡混匀，在4℃条件下10000r/min离心5min，备用。鸡蛋清样品的准备鸡蛋清样品的采集100μL品转移至灭菌离心管中暂存，使用鸡蛋开孔器时应避免样品间交叉污染。鸡蛋清样品的保存与处理4℃6h100uL100μLPBS，充分混合后，备用。肛拭子样品的准备GB/T264364℃存期限不超过6h。接种细胞的准备DF-1细胞，常规传代消化，调整细胞密度为1×105个细胞/mL，接种于24孔1mL70％缓冲液（PBS）清洗细胞面三次后，可用于样品的接种。样品接种鸡血浆样品的接种将4.1.2中处理后的血液样品用移液器吸头轻轻旋转上层血浆，使处于中层的白细胞悬浮于血浆中，吸取100μL血浆接种到DF-1细胞培养孔中，另设阴阳性对照孔，样品孔做好标记，并在每个细胞培养孔中加入40μL肝素钠溶液，防止血浆凝固。2公鸡精液样品的接种将4.2.2中处理后的精液样品按照GB/T36873中的方法进行种公鸡精液样品的接种，另设阴阳性对照孔，样品孔做好标记。鸡蛋清样品的接种4.3.2100μLDF-1孔，样品孔做好标记。肛拭子样品的接种应按照GB/T26436中的方法执行，另设阴阳性对照孔，样品孔做好标记。细胞的维持培养将接种样品后的细胞板放入细胞培养箱继续孵育3h后，弃去细胞培养孔中液体，用200μL灭菌PBS润洗细胞孔1次，加入细胞维持培养液1mL，继续培养7～9天，在细胞状态允许的条件下应尽可能延长细胞维持培养的时间，以利于ALV在细胞上的增殖。在24孔培养板靠边的样品孔中多加入0.3mL细胞维持培养液，以补偿样品孔的水分蒸发。8病毒的检测8病毒的检测酶联免疫吸附试验（ELISA）ALVp27NY/T680NY/T680试剂盒说明书执行。间接免疫荧光抗体反应（IFA）ALV应按照GB/T26436中规定的方法执行。聚合酶链式反应（PCR）ALV应按照GB/T26436中规定的的方法执行。3附录A（资料性）试剂的配制细胞完全培养液(pH7.2)DMED高糖培养液（商品化） 450胎牛血清 50mL青霉素 100U/mL链霉素0.1mg/mL细胞维持液DMED高糖培养液（商品化） 495胎牛血清 5mL青霉素 200U/mL链霉素0.2mg/mL磷酸二氢钾十二水磷酸氢二钠蒸馏水8g0.2g0.2磷酸二氢钾十二水磷酸氢二钠蒸馏水8g0.2g0.2g2.83g加至1000mL在温度121°、压力0.12Mpa条件下灭菌15分钟。A.4D-Hank’s200ml121°0.12Mpa条件下灭菌155.6％NaHCO3调pH至7.2～7.6。A.50.25％胰酶消化液D-Hank’s缓冲液胰酶（粉末）100mL0.25g4氯化钠8g氯化钾0.9g磷酸二氢钾0.06g十二水磷酸氢二钠0.152g葡萄糖1g蒸馏水加至1000mL0.5mol/LEDTA 1ML用1mol/LNaOH调节pH至7.2～7.4，用0.22um的滤器过滤除菌。1mg/mL肝素钠（