DNA复制突变、修复汇总课件

第一节DNA的复制一、DNA复制的一般特征（一）半保留复制（semireservativereplication）Watson和Crick于1953年提出的DNA双螺旋模型，碱基互补配对的原则，为DNA分子的复制提供了理论基础，即亲代的DNA双链，每股链都可以作为模板，按碱基互补配对原则指导DNA新链的合成，这样合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代分子完全一样。但一条链是来自亲代的DNA链，另一条链是新合成的链，此即为半保留复制(semiconservativereplication)。第四章DNA的复制、突变、损伤和修复第一节DNA的复制第四章DNA的复制、突变、损伤和修复1DNA复制突变、修复汇总课件2大肠杆菌细胞在15N培养基（重培养基）中培养数代，产生含重氮（15N）的大分子（包括15N-DNA分子），而后移到正常培养基（14N）上培养，在不同时间提取DNA样品并在CsCl溶液中超速离心。Cscl溶液在超速离心下形成密度梯度。DNA分子在该密度梯度中迁移，并在与其密度与溶液密度相同点达平衡。E.coligrownmanygenerationsin15Nmedium(Heavy)15N14NGrowin14Nmedium(light)andsampledaftervariousgenerationsExtractDNAfromcellandcarryout“densitygradientcentrifugation”大肠杆菌细胞在15N培养基（重培养基）中培养数代，产生含重氮3DNA复制突变、修复汇总课件4（二）复制起点、复制子、复制叉、复制方向和复制终点复制起点（originofreplication）DNA的复制是在DNA分子的特定位点开始的，这一位点称为复制起点，常用ori来表示。原核生物的染色体只有一个复制起点，复制从起点开始，进行到终点结束，完成整个染色体DNA分子的复制。许多生物的复制起点都是富含AT配对的区域，因为AT之间是二价氢键，GC之间是三价氢键，AT比GC更易解开。富含AT的区域经常处于开放与闭合的动态平衡状态，称为DNA的呼吸作用。这一区域能产生瞬时单链，单链与单链结合蛋白（single-strandedDNAbindingprotein，ssb)结合，对复制的起始十分重要。（二）复制起点、复制子、复制叉、复制方向和复制终点复制起点（5复制子（replicon）：复制子是基因组中能够独立进行复制的单位。每个复制子都有控制复制开始的复制起点（origin）以及终止复制的终点（terminus）。任何起点和终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。一个DNA分子可以是一个复制子，如细菌的染色体；也可以是几个复制子，如许多真核细胞的染色体。一个失去复制点的DNA分子不能独立进行复制，但是当它的另一个复制子连接起来时，就能在后者的带动下进行复制。复制叉（replicationfork）：DNA分子复制时复制起点两条链解开成单链状态，两条单链分别作为模板，各自合成其互补链，这种Y型的结构成为复制叉。复制叉从复制起点沿DNA链移动，不断扩大直到整个复制子完成复制。复制子（replicon）：复制子是基因组中能够独立进行复制6复制方向：从复制起点开始，大多数进行双向复制，形成两个复制叉，分别等速或不等速复制，少数以单向进行，形成一个复制叉双向复制（bidirectionalreplication）：从固定起始点开始，以双向等速复制方式进行复制，即从原点开始在两个方向各有一个复制叉在延伸，直至与邻近的复制叉汇合，这种方式为双向复制。有的生物两个复制叉移动不对称，如枯草杆菌DNA从原点开始双向复制，一个复制叉移动1/5就停下来，另一个复制叉走完4/5的距离。单向复制（unidirectionalreplication）：有一些DNA复制单向进行，如质粒colE1，从复制起点开始，单方向进行。复制方向：从复制起点开始，大多数进行双向复制，形成两个复制叉7A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABCA.环状双链DNA及复制起始点oriterA8DNA复制突变、修复汇总课件9复制终点：环状DNA复制终点：以大肠杆菌（E.coli）为例：EcoliDNA的两个复制叉一直行进到特殊的终止位点复制终止。现已发现E.coli有两个终止区域（terD,A和terC,B），每一终止序列对某一方向移动的复制叉来说是特异的。终止需要tus基因的产物，其编码蛋白能识别ter信号序列，并阻止复制叉继续前进。有的环状DNA没有特定的终止位点，如λ噬菌体。复制终点：EcoliDNA的两个复制叉一直行进到特殊的10线状DNA分子的复制终点：

问题：根据半保留复制理论，新链复制开始时，首先在5’端合成一段RNA引物，当复制完成后将引物切除，5’端出现一段空缺，由于5’没有游离3’-OH存在，所以无法通过DNA聚合酶将这一段新链中空缺补上。这样随着DNA分子的不断合成，DNA新链会越来越短。但实际上细胞中线状DNA的长度是恒定的。很多线状复制子在复制循环中采取环形构象解决。T7噬菌体的串联体模型：T7DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。在T7DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7DNA长度，而是许多单位长度的T7DNA首尾连接在一起。线状DNA分子的复制终点：问题：根据半保留复制理论，新链复11T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3'端单链尾巴，两个子代DNA的3'端尾巴以互补结合形成两个单位T7DNA的线性连接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7DNA分子。这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。这样的T7DNA分子可以被特异的内切酶切开，用DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3'端单链尾巴，两个子123′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′互补的3′端配对3′5′3′5′PolI和连接酶封闭缺口3′5′3′5′3′5′5′3′限制性酶交错切割3′5′3′5′3′5′3′5′PolI3‘端延伸完成复制3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′13（三）DNA复制的酶学DNA复制过程需要多种酶和蛋白参与。大肠杆菌DNA复制过程需要的酶研究的最清楚。使DNA链解离的酶⑴解旋酶（helicase）：DNA复制时，首先由解旋酶通过水解ATP获得能量，沿5'→3'方向解开DNA双链。E.coli中鉴定出了四种DNA解旋酶。其中dnaB编码的产物DnaB在DNA复制中起作用，真核生物中，也分离纯化了多种DNA解旋酶。⑵单链DNA结合蛋白（single-strandDNA-bindingprotein，SSB）：这类蛋白选择性结合并覆盖在单链DNA上，防止DNA复制过程中，解开的DNA单链被酶水解及重新结合成双链。每个蛋白分子可覆盖32nt（nucleotide）。SSB还可作用于DNA中富含AT区域由于呼吸作用形成的单链。（三）DNA复制的酶学DNA复制过程需要多种酶和蛋白参与。大14⑶DNA旋转酶（topoisomerase，又称拓扑异构酶Ⅱ）：

大多数天然DNA都具有负超螺旋。负超螺旋有利于复制叉的形成并可以缓解由于复制叉的移动而造成的超缠现象。由于DNA是双螺旋结构，所以两条链分离时必须旋转。当5%的环形DNA双链已经复制时，原有的负超螺旋已耗尽。在复制叉处解旋，会使复制叉前方双链进一步扭紧，产生正超螺旋，影响复制叉向前推进。这时由拓扑异构酶切断DNA双链松开正超螺旋并重新使DNA双链连接，形成负超螺旋，DNA旋转酶作用一次产生两个负超螺旋。⑶DNA旋转酶（topoisomerase，又称拓扑异构15

DNA聚合酶（DNApolymerase）⑴原核细胞中的DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ），这是1956年由ArthurKornberg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。PolⅠ只有一条多肽链，分子量102kda，它是一个多功能酶。主要有3种作用：①5'→3'的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3'→5'的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5'→3'外切酶活性。切除受损伤的DNA。它在切口平移（nicktranslation）中应用。DNA聚合酶（DNApolymerase）16Nicktranslationreplacespartofapre-existingstrandofduplexDNAwithnewlysynthesizedmaterial.Nicktranslationreplacespart17DNA聚合酶Ⅰ的另一个重要特点是：通过温和的蛋白水解反应，PolI的多肽链断裂为两部分：一个是比较大的片段称为Klenowfragment，具有3’到5’的外切酶活性和5’到3’的聚合酶活性。另一断裂片断较小，具有的5’到3’外切酶活性。Klenowfragment常用于分子生物学技术上的DNA的合成。可用于填补DNA单链末端成为双链。如果供给32P标记的三磷酸核苷酸，则可使DNA带上同位素标记。当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的DNA片段，要用被切成平头末端的DNA片段连接时，可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头，然后在DNA连接酶作用下把两个DNA片段连接起来。DNA聚合酶Ⅰ的另一个重要特点是：通过温和的蛋白水解反应181971年ThomasKornberg和MalcolmCefter发现了两个新的DNA聚合酶，PolⅡ，PolⅢ。DNA复制需要polⅢ。不需要polⅡ.PolⅢ全酶由、、、、、、、’、、10种不同的亚基组成。其中三个亚基、、组成polⅢ的核心：亚基有DNA聚合酶活性，亚基有3'到5'核酸外切酶活性。亚基功能不清楚。1971年ThomasKornberg和Malcolm19DNA复制突变、修复汇总课件20大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能21大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比较项目DNA聚合酶Ⅲ切除引物修复修复复制功能大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA分子量DNA109，00022⑵真核细胞中的DNA聚合酶：α：在DNA复制中起主要作用，与随后链合成有关；δ：在DNA复制中起主要作用，与领头（前导）链合成有关，具有3′-5′端核酸外切酶的活性；β：修复功能；γ：位于线粒体中，与线粒体DNA复制有关；ε：具3′-5′端核酸外切酶的活性；附属蛋白：具3′-5′端核酸外切酶的活性。⑵真核细胞中的DNA聚合酶：α：在DNA复制中起主要作用，与23真核细胞内有五种DNA聚合酶细胞核＞15’→3’外切酶－高蚜肠霉素修复细胞核23’→5’外切酶－有PCNA时高蚜肠霉素核DNA合成线粒体23’→5’外切酶－高双脱氧TTP线粒体DNA合成细胞核1－－低双脱氧TTP修复细胞核4－＋中等蚜肠霉素引物合成定位亚基数目外切酶活性引物合成酶活性持续合成能力抑制剂功能DNA聚合酶εDNA聚合酶δDNA聚合酶γ

DNA聚合酶β

DNA聚合酶α真核细胞内有五种DNA聚合酶细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核定24（四）DNA的复制过程1．DNA双螺旋的解旋

DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程.2．冈崎片段与半不连续复制（semidiscontinuousreplication）因DNA的两条链是反向平行的，故在复制叉附近解开的DNA链，一条是5’—3’方向，另一条是3’—5’方向，两个模板极性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5’—3’方向，不是3’—5’方向，因而无法解释DNA的两条链同时进行复制的问题。（四）DNA的复制过程1．DNA双螺旋的解旋

DNA在复制251968年冈崎（Okazaki）及其同事进行了一系列实验，回答了这一问题。。1968年冈崎用3H脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌，提取DNA，变性后用超离心方法得到了许多3H标记的，被后人称作冈崎片段的DNA。延长标记时间后，冈崎片段可转变为成熟DNA链，因此这些片段必然是复制过程中的中间产物。1968年冈崎（Okazaki）及其同事进行了一系列实验，回26另一个实验也证明DNA复制过程中首先合成较小的片段:即用DNA连接酶温度敏感突变株进行试验，在连接酶不起作用的温度下，便有大量小DNA片段积累，表明DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再由连接酶链成大分子DNA。原核生物的冈崎片段比真核生物的长。深入研究还证明，前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界具有普遍性，故称为DNA双螺旋的半不连续复制。另一个实验也证明DNA复制过程中首先合成较小的片段:27两条新链具有不同的特征ThetwonewDNAstrandshavedifferentfeaturesOkazakifragment两条新链具有不同的特征ThetwonewDNAstr28前导链(Leadingstrand))和后随链(laggingstrand)的协调合成前导链(Leadingstrand))和后随链(laggi29二、原核生物的DNA复制（一）大肠杆菌（E.coli）基因组复制的起始复制原点：大肠杆菌最小复制原点的DNA序列为245bp。左边有3个13聚体（13bp）的相似回文结构和4个9聚体（9bp）的重复序列（R1，R2，R3，R4）。R1，R3正向，R2，R4反向。这个9聚体是复合起始蛋白DnaA的结合位点，有时也称其为dnaAbox。二、原核生物的DNA复制（一）大肠杆菌（E.coli）基因组30大肠杆菌复制起始区的结构特点是：①富含AT，这可能是和双链易于解开，起始复制有关；②含有多个回文结构，有11个GATC。其中8个GATC较保守，GATC中的“A”已甲基化；③具有R1，R2，R3，R4四个重复序列，作为蛋白结合位点；④此重复序列右侧紧邻两个启动子，其作用可能是：a，转录引物；b，产生复制必须的蛋白；c，产生具有调节功能的RNA；d，起转录激活作用。大肠杆菌复制起始区的结构特点是：31大肠杆菌中的复制起始点是OriC，全长248Bp，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。13442966174209248大肠杆菌中的复制起始点是OriC，全长248Bp，该序列在322.大肠杆菌复制的起始（initiation）⑴复制的引发（priming）：E.coli首先合成一个起始复合体（primosome）也称引发体。2.大肠杆菌复制的起始（initiation）33结合Ori区，具ATP酶活性促进DnaB形成起始复合物

DNA螺旋酶运输DnaBDNA引发酶促进起始复合物形成结合Ori区，具ATP酶活性DNA运输DnaBDNA引发酶34oriC的复制起始：从形成预引发体开始，要求6种蛋白参与

蛋白

功能对蛋白的要求DnaA协同结合于9bp和13个bp重复顺序

20－40单体DnaB结合于DnaA,提供解旋酶活性1－2六聚体DnaC与DnaB形成复合体单体/DnaB六聚体6HU组蛋白样蛋白，促进复合体形成约5个双体Gyrase旋转酶，解除正超螺旋，引入负超螺旋起催化作用SSB稳定单链oriC的复制起始：从形成预引发体开始，要求6种蛋白参与35DnaA协助DnaB结合到oriC↓RNA聚合酶合成一个RNA短片段，并形成R环（R-loop）并与oriC连接。↓HU诱导双链DNA弯曲。R环和DNA的弯曲造成DNA双螺旋不稳定，使DNA易于解链。解链反应还需要旋转酶解旋及SSB结合于解开的DNA链上，使其稳定。↓DnaB刺激引物酶（dnaC蛋白）的结合，从而形成引发体。（引发体一直存在复制过程中，有两个作用：在后随链冈崎片段的合成中起引发作用，dnaB蛋白作为螺旋酶，使DNA解链。）DNA复制的引发过程大致如下：DnaA协助DnaB结合到oriCDNA复制的引发过程大致如36⑴复制的延伸（elongation）：引发体一旦形成，DNA双链解开形成复制叉，双向合成DNA。先导链的合成：以3′→5′亲本链为模板，由引发体中dnaC蛋白合成引物（primer），DNA聚合酶Ⅲ全酶从引物3′-OH开始，以5′→3′方向前进合成一条DNA新链，称为先导链。后随链的合成：随着先导链的延伸置换出后后随链的模板，当后随链模板上RNA引物信号序列出现即合成RNA引物，然后由DNA聚合酶Ⅲ延伸合成冈崎片段。DNA聚合酶I切除引物，并填补引物切除后留下的空缺，由DNA连接酶将片段连接起来。后随链需要周期性地引发，因此其合成进度总是与先导链相差一个冈崎片段的距离。⑴复制的延伸（elongation）：37复制的延伸复制的延伸38（二）大肠杆菌DNA复制的终止当子链延伸达到terminusregion（ter，带有多个22bp序列），DNA复制终止。在E.coli中终止位点为TerE-TerF排列。Ter位点结合Tus蛋白（terminusutilizationsubstance）复制叉进入终止区域后暂停。停止后留下两个缠绕的子代DNA分子，称为子代二价体（细胞分裂前他们必须分离，否则影响它们分配到子代细胞中）。由于E.coliDNA的环状特征，两个子代二价体像一个连环套缠绕在一起。两条子代DNA上带有缺口，如果两个子代二价体在DNA修复前解套，则由拓扑异构酶I在亲本链上打开缺口，两个子代DNA解套分离。如果首先进行修复反应，即子代DNA上的缺口在修复前封闭，则由拓扑异构酶Ⅱ在双链上打开缺口，使子代DNA解套。（二）大肠杆菌DNA复制的终止39oric复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制叉2完成复制DNA拓扑异构酶连锁染色体oric复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制40三、真核生物DNA复制（一）真核细胞DNA复制的起始点（origin）与原核生物不同，真核生物DNA复制有许多起始点，例如酵母S.cerevisiae的17号染色体约有400个起始点，一般一个哺乳动物细胞中约50000-100000个复制叉同时复制。因此，虽然真核生物DNA复制的速度(60核苷酸/每秒钟)比原核生物DNA复制的速度(E.coli1700核苷酸/每秒钟)慢得多，但复制全部基因组DNA也只要几分钟的时间。SV40的复制起点:SV40复制依赖宿主细胞的复制系统，通过对其DNA复制的研究可了解其复杂的宿主细胞的复制情况。三、真核生物DNA复制（一）真核细胞DNA复制的起始点41SV40基因组为5kb，双链环状。只有一个复制原点，并发现复制叉向两个方向移动。SV40DNA起始原点的核心序列（oricore）为一段64bp的序列，这段序列包括几个必要的元件：四个5′-GAGGC-3′序列，是T抗原（largerTantigen）的结合位点。一个15bp的回文结构，是DNA复制过程中最早解链的区域。一个只有AT组成的17bp区域，促进解链。参与起始过程的还包括与核心序列相邻的两个T抗原结合位点和其左边的GCboxes。T抗原结合到SV40ori，它的DNA螺旋酶活性使DNA解旋，准备合成引物。SV40基因组为5kb，双链环状。只有一个复制原点，并发现复42Figure1：StructuralandfunctionalelementsofSV40DNAreplicationsystem.(A)Sequencespresentinthe64-bpcoreoriginofSV40replication.LocationsoftheAT-richregion,thepentanucleotidebox(PEN)andEPsites,numberedasinthegenomeofreferencestrain776.ArrowsdepictthefourGAGGCpentanucleotides—thebindingsitesforT-agOBDs(blueellipses).EightnucleotideswithintheEPthatmeltupontheT-agdoublehexamerassemblyarehighlightedinyellow.The23bpPENelementstructurereportedinthisworkisboxed.Figure1：Structuralandfuncti432.酵母的复制起始点：酵母是最简单的真核生物，1979年，Hsiao和Carbon发现酵母的一段DNA序列能独立复制，说明这段序列含有复制的起始原点，这段序列成为自主复制序列1（autonomomouslyreplicatingsequence1，ARS1）。酵母DNA中复制起始原点的最小长度仅为11bp，并具有[A/T]TTTAT[A/G]TTT[A/T]序列。这段序列与起始点识别复合物（originrecognitioncomplex，ORC）连接在一起。依赖周期素的蛋白激酶（cyclindependentproteinkinase，CDKs）激活ORC后，ORC打开DNA准备复制。2.酵母的复制起始点：44DNA复制突变、修复汇总课件45（二）真核细胞DNA复制过程解链真核细胞的DNA以核小体形式存在。复制前，DNA必须从核小体内解开并形成复制子，这使复制子的移动速度减慢到约50bp/秒，所以真核生物是以多个复制子同时进行复制。真核细胞DNA解链需要DNA螺旋酶、单链结合蛋白和复制蛋白（replicationproteinA，RPA）。合成引物并延长真核细胞内DNA引物酶和polα紧密偶联。由引物酶合成先导链和后随链冈崎片段的RNA引物，接着在DNA聚合酶α催化下引物3′端末端合成一段DNA，然后先导链上的DNA聚合酶α很快被DNA聚合酶δ取代，而后随链上的被DNA聚合酶ε取代，这两个酶都有校正功能。（二）真核细胞DNA复制过程解链真核细胞的DNA以核小体46DNA复制突变、修复汇总课件47（三）真核细胞DNA复制的终止端粒的复制：端粒是真核细胞染色体的特殊结构。由简单的不含遗传信息的重复序列组成，重复次数从数十次到上万次。可以形成反折式二级结构，其中3′端突出。5′-TTGGGGTTGGGG（TTGGGG）nTTGGGG-3′3′-AACCCCAACCCC-5′这个富含G的端粒由端粒酶催化产生。端粒酶是一种含有端的RNA分子的蛋白质复合物，具有逆转录活性，以RNA作为模板进行逆转录。与上述重复序列的3′突出末端结合，以突出的3′末端重复序列为引物合成一段长度不等的重复序列5′-GGGTTG-3′。并重复此过程。（三）真核细胞DNA复制的终止端粒的复制：端粒是真核细胞染色48DNA复制突变、修复汇总课件49母链延长至一定长度后，端粒酶脱离母链，母链以其3`-OH反折，同时起引物和模板的作用DNA聚合酶完成末端双链的复制母链延长至一定长度后，端粒酶脱离母链，母链以其3`-OH反折502.端粒酶与药物（1）针对端粒酶中的RNA（hTR）或端粒酶活性催化亚基（humantelomerasecatalyticsubunithTERT）的mRNA设计反义核苷酸。（2）核酶（ribozyme，RZ)：Kanazawa等设计了一种直接作用于端粒酶的锤头状核酶（teloRZ），发现其对人工合成的端粒酶RNA有专一性降解作用，当把teloRZ加入到人肝癌细胞系HepG2和Huh-7的端粒酶提取物中时，能有效抑制端粒酶的活性。（3）逆转录酶抑制剂：利用逆转录酶拟制剂抑制端粒酶活性。如3′-叠氮胸苷（3′-azidothymidine，AZT）可作为逆转录酶抑制剂治疗获得性免疫缺陷病。2.端粒酶与药物51（四）真核细胞DNA复制过程中的核小体结构在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上，新合成的组蛋白与后滞链组装成核小体。因此，DNA的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。这些主要是通过环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微镜下观察进行实验证据的。（四）真核细胞DNA复制过程中的核小体结构在真核生物的复制子52真核生物复制过程中的核小体结构DNA合成后很快与组蛋白结合，装配成核小体，用3H-Tdr标记DNA，14C,15N标记组蛋白，发现新合成的DNA链几分钟内即与新合成的组蛋白八聚体组装成核小体。DNA属于半保留复制，那么组蛋白八聚体是以何种方式传递给子代分子呢？这主要涉及以下3个问题：

1、老的组蛋白8聚体是否解聚实验证明组蛋白8聚体以全保留的方式传给子代分子（不解聚，只传给一条DNA链）。真核生物复制过程中的核小体结构53现将得到这一结论的实验过程叙述如下：将细胞置于轻培养基（12C,14N,1H）中生长很长时间。然后将细胞转移到重培养基（14C,15N,3H）中生长约1小时，分离组蛋白八聚体，在甲酸饱和的密度梯度中进行平衡离心。如果是全保留装配的话，则得到一个高密度的放射性带；如果是随机的话，则得到一个高密度到低密度的弥散的放射性带；如果是半保留的话，则在中等密度处得一个单一的放射性带；结果表明，组蛋白八聚体的装配是全保留的。现将得到这一结论的实验过程叙述如下：542、老的组蛋白8聚体在子链DNA上的排列这些老的八聚体和新的八聚体在两条子代DNA分子上是如何排列的呢？同样有三类可能性：①老八聚体进入一条链，②间插分布，③随机分布。

用蛋白质合成的抑制剂放线菌酮（cycloheximide）加到正在生长的细胞中，在此之前开始的一轮DNA复制将继续下去。组蛋白是现用现造，在加入蛋白质合成的抑制剂后，就没有新生的组蛋白八聚体了。这样在两个复制叉的两边，有一个分枝的DNA是裸露的。另一个分枝继承了亲代的组蛋白八聚体。用电子显徽镜可以看到这种现象。这一结果表明，组蛋白八聚体在DNA复制时并不离开亲本DNA链。2、老的组蛋白8聚体在子链DNA上的排列这些老的八聚体和553、老的组蛋白八聚体与哪条链结合:老的即亲代的组蛋白八聚体到底与哪条链相结合？迄今，从一种动物病毒SV40的研究结果看，它的老八聚体是与先导链相结合的〔SV40也有核小体结构〕。如果一个复制单元从原点开始双向等速复制，则在子代分子的这一段序列上的组蛋白八聚体半截是老的，半截是新的。3、老的组蛋白八聚体与哪条链结合:56四、线粒体DNA复制（一）线粒体DNA结构绝大多数是环状DNA分子，少数低等真核生物的线粒体基因组是线状DNA分子外(如纤毛原生动物Tetrahymenapyniform和Parameciumaurelia以及绿藻Clamydoomonasrein—hardtia等)一个细胞里有许多个线粒体，而且一个线粒体里也有几份基因组拷贝，所以一个细胞里也就有许多个线粒体基因组。不同物种的线粒体基因组的大小相差悬殊。已知的是哺乳动物的线粒体基因组最小，果蝇和蛙的稍大，酵母的更大，而植物的线粒体基因组最大。四、线粒体DNA复制（一）线粒体DNA结构57人mtDNA是一个长为16,569bp的双链闭合环状分子，外环含G较多，称重链(H链)，内环含C较多，称轻链(L链)。mtDNA结构紧凑，没有内含子，唯一的非编码区是D环区，长约1,000bp左右。D环区包括mtDNA重链复制起始点，重轻链转录的启动子。线粒体的H链是12种多肽链、12SrRNA、16SrRNA和14种tRNA的转录模板，L链是1种多肽链和8种tRNA转录的模板。mtDNA的结构特征人mtDNA是一个长为16,569bp的双链闭合环状分子，58DNA复制突变、修复汇总课件59（二）线粒体DNA复制过程：以取代环（displacedloop）也称D环（D-loop）的方式复制。H链首先合成：从重链的复制起点（OH）处以H链为模板，以顺时针方向延伸合成新的L链，新L链与H链以氢键结合，原来的L链保持单链状态，产生一种D环复制中间物。H链片段的继续合成：当复制继续到1/3序列时，暴露出轻链起始点（OL）

，启动轻链以逆时针方向复制。复制完成，以环状双螺旋形式释放，形成两条线粒体环形DNA分子。（二）线粒体DNA复制过程：60DNA复制突变、修复汇总课件61（三）线粒体基因与疾病mtDNA的遗传特征:mtDNA比核DNA重复性小，信息密度高，无内含子序列mtDNA的部分区域呈基因重叠，这个区域内的任何一种突变都将影响线粒体的功能。mtDNA突变频率高于核DNA，并缺乏修复功能。对mtDNA分子病理学的研究证实mtDNA突变在许多疾病中存在，包括具有母系遗传特征的疾病，中老年时发病的一些退化性疾病，甚至衰老本身。（三）线粒体基因与疾病62mtDNA突变引起的疾病：Leber遗传性视神经病是被证实的第一种母系遗传的疾病，至今尚未发现一个男性患者将此病传给后代。由于视神经炎引起视神经的萎缩，已知涉及突变位点共9个；神经源性肌软弱，共济失调伴视网膜色素变性,该疾病是由于mtDNA第8993核苷酸T变成了G，使ATP酶第6亚基的第156位亮氨酸变为精氨酸；阿尔兹海默病：第5460核苷酸发生G→A突变；线粒体耳聋：mt-12SrRNA基因是与耳聋相关的一个突变热点,其上的一些点突变(如A1555G、T961C和C1494T等)已经被证实能够引发耳聋;帕金森氏病：该病部分患者脑、血小板及肌肉线粒体中酶复合物I缺乏。mtDNA突变引起的疾病：63DNA复制突变、修复汇总课件64DNA复制突变、修复汇总课件65第一节DNA的复制一、DNA复制的一般特征（一）半保留复制（semireservativereplication）Watson和Crick于1953年提出的DNA双螺旋模型，碱基互补配对的原则，为DNA分子的复制提供了理论基础，即亲代的DNA双链，每股链都可以作为模板，按碱基互补配对原则指导DNA新链的合成，这样合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代分子完全一样。但一条链是来自亲代的DNA链，另一条链是新合成的链，此即为半保留复制(semiconservativereplication)。第四章DNA的复制、突变、损伤和修复第一节DNA的复制第四章DNA的复制、突变、损伤和修复66DNA复制突变、修复汇总课件67大肠杆菌细胞在15N培养基（重培养基）中培养数代，产生含重氮（15N）的大分子（包括15N-DNA分子），而后移到正常培养基（14N）上培养，在不同时间提取DNA样品并在CsCl溶液中超速离心。Cscl溶液在超速离心下形成密度梯度。DNA分子在该密度梯度中迁移，并在与其密度与溶液密度相同点达平衡。E.coligrownmanygenerationsin15Nmedium(Heavy)15N14NGrowin14Nmedium(light)andsampledaftervariousgenerationsExtractDNAfromcellandcarryout“densitygradientcentrifugation”大肠杆菌细胞在15N培养基（重培养基）中培养数代，产生含重氮68DNA复制突变、修复汇总课件69（二）复制起点、复制子、复制叉、复制方向和复制终点复制起点（originofreplication）DNA的复制是在DNA分子的特定位点开始的，这一位点称为复制起点，常用ori来表示。原核生物的染色体只有一个复制起点，复制从起点开始，进行到终点结束，完成整个染色体DNA分子的复制。许多生物的复制起点都是富含AT配对的区域，因为AT之间是二价氢键，GC之间是三价氢键，AT比GC更易解开。富含AT的区域经常处于开放与闭合的动态平衡状态，称为DNA的呼吸作用。这一区域能产生瞬时单链，单链与单链结合蛋白（single-strandedDNAbindingprotein，ssb)结合，对复制的起始十分重要。（二）复制起点、复制子、复制叉、复制方向和复制终点复制起点（70复制子（replicon）：复制子是基因组中能够独立进行复制的单位。每个复制子都有控制复制开始的复制起点（origin）以及终止复制的终点（terminus）。任何起点和终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。一个DNA分子可以是一个复制子，如细菌的染色体；也可以是几个复制子，如许多真核细胞的染色体。一个失去复制点的DNA分子不能独立进行复制，但是当它的另一个复制子连接起来时，就能在后者的带动下进行复制。复制叉（replicationfork）：DNA分子复制时复制起点两条链解开成单链状态，两条单链分别作为模板，各自合成其互补链，这种Y型的结构成为复制叉。复制叉从复制起点沿DNA链移动，不断扩大直到整个复制子完成复制。复制子（replicon）：复制子是基因组中能够独立进行复制71复制方向：从复制起点开始，大多数进行双向复制，形成两个复制叉，分别等速或不等速复制，少数以单向进行，形成一个复制叉双向复制（bidirectionalreplication）：从固定起始点开始，以双向等速复制方式进行复制，即从原点开始在两个方向各有一个复制叉在延伸，直至与邻近的复制叉汇合，这种方式为双向复制。有的生物两个复制叉移动不对称，如枯草杆菌DNA从原点开始双向复制，一个复制叉移动1/5就停下来，另一个复制叉走完4/5的距离。单向复制（unidirectionalreplication）：有一些DNA复制单向进行，如质粒colE1，从复制起点开始，单方向进行。复制方向：从复制起点开始，大多数进行双向复制，形成两个复制叉72A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABCA.环状双链DNA及复制起始点oriterA73DNA复制突变、修复汇总课件74复制终点：环状DNA复制终点：以大肠杆菌（E.coli）为例：EcoliDNA的两个复制叉一直行进到特殊的终止位点复制终止。现已发现E.coli有两个终止区域（terD,A和terC,B），每一终止序列对某一方向移动的复制叉来说是特异的。终止需要tus基因的产物，其编码蛋白能识别ter信号序列，并阻止复制叉继续前进。有的环状DNA没有特定的终止位点，如λ噬菌体。复制终点：EcoliDNA的两个复制叉一直行进到特殊的75线状DNA分子的复制终点：

问题：根据半保留复制理论，新链复制开始时，首先在5’端合成一段RNA引物，当复制完成后将引物切除，5’端出现一段空缺，由于5’没有游离3’-OH存在，所以无法通过DNA聚合酶将这一段新链中空缺补上。这样随着DNA分子的不断合成，DNA新链会越来越短。但实际上细胞中线状DNA的长度是恒定的。很多线状复制子在复制循环中采取环形构象解决。T7噬菌体的串联体模型：T7DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。在T7DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7DNA长度，而是许多单位长度的T7DNA首尾连接在一起。线状DNA分子的复制终点：问题：根据半保留复制理论，新链复76T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3'端单链尾巴，两个子代DNA的3'端尾巴以互补结合形成两个单位T7DNA的线性连接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7DNA分子。这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。这样的T7DNA分子可以被特异的内切酶切开，用DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3'端单链尾巴，两个子773′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′互补的3′端配对3′5′3′5′PolI和连接酶封闭缺口3′5′3′5′3′5′5′3′限制性酶交错切割3′5′3′5′3′5′3′5′PolI3‘端延伸完成复制3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′78（三）DNA复制的酶学DNA复制过程需要多种酶和蛋白参与。大肠杆菌DNA复制过程需要的酶研究的最清楚。使DNA链解离的酶⑴解旋酶（helicase）：DNA复制时，首先由解旋酶通过水解ATP获得能量，沿5'→3'方向解开DNA双链。E.coli中鉴定出了四种DNA解旋酶。其中dnaB编码的产物DnaB在DNA复制中起作用，真核生物中，也分离纯化了多种DNA解旋酶。⑵单链DNA结合蛋白（single-strandDNA-bindingprotein，SSB）：这类蛋白选择性结合并覆盖在单链DNA上，防止DNA复制过程中，解开的DNA单链被酶水解及重新结合成双链。每个蛋白分子可覆盖32nt（nucleotide）。SSB还可作用于DNA中富含AT区域由于呼吸作用形成的单链。（三）DNA复制的酶学DNA复制过程需要多种酶和蛋白参与。大79⑶DNA旋转酶（topoisomerase，又称拓扑异构酶Ⅱ）：

大多数天然DNA都具有负超螺旋。负超螺旋有利于复制叉的形成并可以缓解由于复制叉的移动而造成的超缠现象。由于DNA是双螺旋结构，所以两条链分离时必须旋转。当5%的环形DNA双链已经复制时，原有的负超螺旋已耗尽。在复制叉处解旋，会使复制叉前方双链进一步扭紧，产生正超螺旋，影响复制叉向前推进。这时由拓扑异构酶切断DNA双链松开正超螺旋并重新使DNA双链连接，形成负超螺旋，DNA旋转酶作用一次产生两个负超螺旋。⑶DNA旋转酶（topoisomerase，又称拓扑异构80

DNA聚合酶（DNApolymerase）⑴原核细胞中的DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ），这是1956年由ArthurKornberg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。PolⅠ只有一条多肽链，分子量102kda，它是一个多功能酶。主要有3种作用：①5'→3'的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3'→5'的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5'→3'外切酶活性。切除受损伤的DNA。它在切口平移（nicktranslation）中应用。DNA聚合酶（DNApolymerase）81Nicktranslationreplacespartofapre-existingstrandofduplexDNAwithnewlysynthesizedmaterial.Nicktranslationreplacespart82DNA聚合酶Ⅰ的另一个重要特点是：通过温和的蛋白水解反应，PolI的多肽链断裂为两部分：一个是比较大的片段称为Klenowfragment，具有3’到5’的外切酶活性和5’到3’的聚合酶活性。另一断裂片断较小，具有的5’到3’外切酶活性。Klenowfragment常用于分子生物学技术上的DNA的合成。可用于填补DNA单链末端成为双链。如果供给32P标记的三磷酸核苷酸，则可使DNA带上同位素标记。当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的DNA片段，要用被切成平头末端的DNA片段连接时，可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头，然后在DNA连接酶作用下把两个DNA片段连接起来。DNA聚合酶Ⅰ的另一个重要特点是：通过温和的蛋白水解反应831971年ThomasKornberg和MalcolmCefter发现了两个新的DNA聚合酶，PolⅡ，PolⅢ。DNA复制需要polⅢ。不需要polⅡ.PolⅢ全酶由、、、、、、、’、、10种不同的亚基组成。其中三个亚基、、组成polⅢ的核心：亚基有DNA聚合酶活性，亚基有3'到5'核酸外切酶活性。亚基功能不清楚。1971年ThomasKornberg和Malcolm84DNA复制突变、修复汇总课件85大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能86大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比较项目DNA聚合酶Ⅲ切除引物修复修复复制功能大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA分子量DNA109，00087⑵真核细胞中的DNA聚合酶：α：在DNA复制中起主要作用，与随后链合成有关；δ：在DNA复制中起主要作用，与领头（前导）链合成有关，具有3′-5′端核酸外切酶的活性；β：修复功能；γ：位于线粒体中，与线粒体DNA复制有关；ε：具3′-5′端核酸外切酶的活性；附属蛋白：具3′-5′端核酸外切酶的活性。⑵真核细胞中的DNA聚合酶：α：在DNA复制中起主要作用，与88真核细胞内有五种DNA聚合酶细胞核＞15’→3’外切酶－高蚜肠霉素修复细胞核23’→5’外切酶－有PCNA时高蚜肠霉素核DNA合成线粒体23’→5’外切酶－高双脱氧TTP线粒体DNA合成细胞核1－－低双脱氧TTP修复细胞核4－＋中等蚜肠霉素引物合成定位亚基数目外切酶活性引物合成酶活性持续合成能力抑制剂功能DNA聚合酶εDNA聚合酶δDNA聚合酶γ

DNA聚合酶β

DNA聚合酶α真核细胞内有五种DNA聚合酶细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核定89（四）DNA的复制过程1．DNA双螺旋的解旋

DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程.2．冈崎片段与半不连续复制（semidiscontinuousreplication）因DNA的两条链是反向平行的，故在复制叉附近解开的DNA链，一条是5’—3’方向，另一条是3’—5’方向，两个模板极性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5’—3’方向，不是3’—5’方向，因而无法解释DNA的两条链同时进行复制的问题。（四）DNA的复制过程1．DNA双螺旋的解旋

DNA在复制901968年冈崎（Okazaki）及其同事进行了一系列实验，回答了这一问题。。1968年冈崎用3H脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌，提取DNA，变性后用超离心方法得到了许多3H标记的，被后人称作冈崎片段的DNA。延长标记时间后，冈崎片段可转变为成熟DNA链，因此这些片段必然是复制过程中的中间产物。1968年冈崎（Okazaki）及其同事进行了一系列实验，回91另一个实验也证明DNA复制过程中首先合成较小的片段:即用DNA连接酶温度敏感突变株进行试验，在连接酶不起作用的温度下，便有大量小DNA片段积累，表明DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再由连接酶链成大分子DNA。原核生物的冈崎片段比真核生物的长。深入研究还证明，前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界具有普遍性，故称为DNA双螺旋的半不连续复制。另一个实验也证明DNA复制过程中首先合成较小的片段:92两条新链具有不同的特征ThetwonewDNAstrandshavedifferentfeaturesOkazakifragment两条新链具有不同的特征ThetwonewDNAstr93前导链(Leadingstrand))和后随链(laggingstrand)的协调合成前导链(Leadingstrand))和后随链(laggi94二、原核生物的DNA复制（一）大肠杆菌（E.coli）基因组复制的起始复制原点：大肠杆菌最小复制原点的DNA序列为245bp。左边有3个13聚体（13bp）的相似回文结构和4个9聚体（9bp）的重复序列（R1，R2，R3，R4）。R1，R3正向，R2，R4反向。这个9聚体是复合起始蛋白DnaA的结合位点，有时也称其为dnaAbox。二、原核生物的DNA复制（一）大肠杆菌（E.coli）基因组95大肠杆菌复制起始区的结构特点是：①富含AT，这可能是和双链易于解开，起始复制有关；②含有多个回文结构，有11个GATC。其中8个GATC较保守，GATC中的“A”已甲基化；③具有R1，R2，R3，R4四个重复序列，作为蛋白结合位点；④此重复序列右侧紧邻两个启动子，其作用可能是：a，转录引物；b，产生复制必须的蛋白；c，产生具有调节功能的RNA；d，起转录激活作用。大肠杆菌复制起始区的结构特点是：96大肠杆菌中的复制起始点是OriC，全长248Bp，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。13442966174209248大肠杆菌中的复制起始点是OriC，全长248Bp，该序列在972.大肠杆菌复制的起始（initiation）⑴复制的引发（priming）：E.coli首先合成一个起始复合体（primosome）也称引发体。2.大肠杆菌复制的起始（initiation）98结合Ori区，具ATP酶活性促进DnaB形成起始复合物

DNA螺旋酶运输DnaBDNA引发酶促进起始复合物形成结合Ori区，具ATP酶活性DNA运输DnaBDNA引发酶99oriC的复制起始：从形成预引发体开始，要求6种蛋白参与

蛋白

功能对蛋白的要求DnaA协同结合于9bp和13个bp重复顺序

20－40单体DnaB结合于DnaA,提供解旋酶活性1－2六聚体DnaC与DnaB形成复合体单体/DnaB六聚体6HU组蛋白样蛋白，促进复合体形成约5个双体Gyrase旋转酶，解除正超螺旋，引入负超螺旋起催化作用SSB稳定单链oriC的复制起始：从形成预引发体开始，要求6种蛋白参与100DnaA协助DnaB结合到oriC↓RNA聚合酶合成一个RNA短片段，并形成R环（R-loop）并与oriC连接。↓HU诱导双链DNA弯曲。R环和DNA的弯曲造成DNA双螺旋不稳定，使DNA易于解链。解链反应还需要旋转酶解旋及SSB结合于解开的DNA链上，使其稳定。↓DnaB刺激引物酶（dnaC蛋白）的结合，从而形成引发体。（引发体一直存在复制过程中，有两个作用：在后随链冈崎片段的合成中起引发作用，dnaB蛋白作为螺旋酶，使DNA解链。）DNA复制的引发过程大致如下：DnaA协助DnaB结合到oriCDNA复制的引发过程大致如101⑴复制的延伸（elongation）：引发体一旦形成，DNA双链解开形成复制叉，双向合成DNA。先导链的合成：以3′→5′亲本链为模板，由引发体中dnaC蛋白合成引物（primer），DNA聚合酶Ⅲ全酶从引物3′-OH开始，以5′→3′方向前进合成一条DNA新链，称为先导链。后随链的合成：随着先导链的延伸置换出后后随链的模板，当后随链模板上RNA引物信号序列出现即合成RNA引物，然后由DNA聚合酶Ⅲ延伸合成冈崎片段。DNA聚合酶I切除引物，并填补引物切除后留下的空缺，由DNA连接酶将片段连接起来。后随链需要周期性地引发，因此其合成进度总是与先导链相差一个冈崎片段的距离。⑴复制的延伸（elongation）：102复制的延伸复制的延伸103（二）大肠杆菌DNA复制的终止当子链延伸达到terminusregion（ter，带有多个22bp序列），DNA复制终止。在E.coli中终止位点为TerE-TerF排列。Ter位点结合Tus蛋白（terminusutilizationsubstance）复制叉进入终止区域后暂停。停止后留下两个缠绕的子代DNA分子，称为子代二价体（细胞分裂前他们必须分离，否则影响它们分配到子代细胞中）。由于E.coliDNA的环状特征，两个子代二价体像一个连环套缠绕在一起。两条子代DNA上带有缺口，如果两个子代二价体在DNA修复前解套，则由拓扑异构酶I在亲本链上打开缺口，两个子代DNA解套分离。如果首先进行修复反应，即子代DNA上的缺口在修复前封闭，则由拓扑异构酶Ⅱ在双链上打开缺口，使子代DNA解套。（二）大肠杆菌DNA复制的终止104oric复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制叉2完成复制DNA拓扑异构酶连锁染色体oric复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制105三、真核生物DNA复制（一）真核细胞DNA复制的起始点（origin）与原核生物不同，真核生物DNA复制有许多起始点，例如酵母S.cerevisiae的17号染色体约有400个起始点，一般一个哺乳动物细胞中约50000-100000个复制叉同时复制。因此，虽然真核生物DNA复制的速度(60核苷酸/每秒钟)比原核生物DNA复制的速度(E.coli1700核苷酸/每秒钟)慢得多，但复制全部基因组DNA也只要几分钟的时间。SV40的复制起点:SV40复制依赖宿主细胞的复制系统，通过对其DNA复制的研究可了解其复杂的宿主细胞的复制情况。三、真核生物DNA复制（一）真核细胞DNA复制的起始点106SV40基因组为5kb，双链环状。只有一个复制原点，并发现复制叉向两个方向移动。SV40DNA起始原点的核心序列（oricore）为一段64bp的序列，这段序列包括几个必要的元件：四个5′-GAGGC-3′序列，是T抗原（largerTantigen）的结合位点。一个15bp的回文结构，是DNA复制过程中最早解链的区域。一个只有AT组成的17bp区域，促进解链。参与起始过程的还包括与核心序列相邻的两个T抗原结合位点和其左边的GCboxes。T抗原结合到SV40ori，它的DNA螺旋酶活性使DNA解旋，准备合成引物。SV40基因组为5kb，双链环状。只有一个复制原点，并发现复107Figure1：StructuralandfunctionalelementsofSV40DNAreplicationsystem.(A)Sequencespresentinthe64-bpcoreoriginofSV40replication.LocationsoftheAT-richregion,thepentanucleotidebox(PEN)andEPsites,numberedasinthegenomeofreferencestrain776.ArrowsdepictthefourGAGGCpentanucleotides—thebindingsitesforT-agOBDs(blueellipses).EightnucleotideswithintheEPthatmeltupontheT-agdoublehexamerassemblyarehighlightedinyellow.The23bpPENelementstructurereportedinthisworkisboxed.Figure1：Structuralandfuncti1082.酵母的复制起始点：酵母是最简单的真核生物，1979年，Hsiao和Carbon发现酵母的一段DNA序列能独立复制，说明这段序列含有复制的起始原点，这段序列成为自主复制序列1（autonomomouslyreplicatingsequence1，ARS1）。酵母DNA中复制起始原点的最小长度仅为11bp，并具有[A/T]TTTAT[A/G]TTT[A/T]序列。这段序列与起始点识别复合物（originrecognitioncomplex，ORC）连接在一起。依赖周期素的蛋白激酶（cyclindependentproteinkinase，CDKs）激活ORC后，ORC打开DNA准备复制。2.酵母的复制起始点：109DNA复制突变、修复汇总课件110（二）真核细胞DNA复制过程解链真核细胞的DNA以核小体形式存在。复制前，DNA必须从核小体内解开并形成复制子，这使复制子的移动速度减慢到约50bp/秒，所以真核生物是以多个复制子同时进行复制。真核细胞DNA解链需要DNA螺旋酶、单链结合蛋白和复制蛋白（replicationproteinA，RPA）。合成引物并延长真核细胞内DNA引物酶和polα紧密偶联。由引物酶合成先导链和后随链冈崎片段的RNA引物，接着在DNA聚合酶α催化下引物3′端末端合成一段DNA，然后先导链上的DNA聚合酶α很快被DNA聚合酶δ取代，而后随链上的被DNA聚合酶ε取代，这两个酶都有校正功能。（二）真核细胞DNA复制过程解链真核细胞的DNA以核小体111DNA复制突变、修复汇总课件112（三）真核细胞DNA复制的终止端粒的复制：端粒是真核细胞染色体的特殊结构。由简单的不含遗传信息的重复序列组成，重复次数从数十次到上万次。可以形成反折式二级结构，其中3′端突出。5′-TTGGGGTTGGGG（TTGGGG）nTTGGGG-3′3′-AACCCCAACCCC-5′这个富含G的端粒由端粒酶催化产生。端粒酶是一种含有端的RNA分子的蛋白质复合物，具有逆转录活性，以RNA作为模板进行逆转录。与上述重复序列的3′突出末端结合，以突出的3′末端重复序列为引物合成一段长度不等的重复序列5′-GGGTTG-3′。并重复此过程。（三）真核细胞DNA复制的终止端粒的复制：端粒是真核细胞染色113DNA复制突变、修复汇总课件114母链延长至一定长度后，端粒酶脱离母链，母链以其3`-OH反折，同时起引物和模板的作用DNA聚合酶完成末端双链的复制母链延长至一定长度后，端粒酶脱离母链，母链以其3`-OH反折1152.端粒酶与药物（1）针对端粒酶中的RNA（hTR）或端粒酶活性催化亚基（humantelomerasecatalyticsubunithTERT）的mRNA设计反义核苷酸。（2）核酶（ribozyme，RZ)：Kanazawa等设计了一种直接作用于端粒酶的锤头状核酶（