纯化与精制 色谱技术概要课件

1.2.4纯化与精制-色谱技术概述吸附色谱离子交换色谱凝胶过滤亲和色谱11/17/202211.2.4纯化与精制-色谱技术概述11/11/20221第一节色谱分离技术概述1.色谱技术概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同，经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。2.特点：（1）

纯化倍数高（2）操作规模小，放大困难（3）

终产品纯化（4）适用于价格昂贵的产品11/17/20222第一节色谱分离技术概述1.色谱技术概念：色谱技术是一组相关3.色谱系统的基本组成11/17/202233.色谱系统的基本组成11/11/20223PharmaciaÄKTA层析系统11/17/20224PharmaciaÄKTA层析系统11/11/211/17/2022511/11/202254.色谱的分类（1）根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类凝胶色谱亲和色谱离子交换色谱分离法吸附色谱法分配色谱法11/17/202264.色谱的分类（1）根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的（2）根据固定相的形状不同的分类：

柱色谱法薄层色谱法11/17/20227（2）根据固定相的形状不同的分类：柱色谱法薄层色谱法11/（3）根据流动相的物态不同的分类：

液相色谱（LC）：LLC、LSC反相色谱：固定相极性小于流动相（4）根据流动相与固定相的极性分类：

正相色谱：固定相极性大于流动相气相色谱（GC）：GLC、GSC11/17/20228（3）根据流动相的物态不同的分类：液相色谱（LC）：LL5.色谱分离的基本原理任何色谱分离过程实质上都是溶质随流动相流动而迁移的过程，不同溶质在流动相和固定相中的分配比例不同，因而随流动相迁移的速度不同，从而使不同物质分离开来。11/17/202295.色谱分离的基本原理任何色谱分离过程实质上都是溶质随流动相5.1色谱分离的基本原理（1）分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值可由Langmuir方程得出Kd---分配系数q、c---溶质在固相和液相中的浓度11/17/2022105.1色谱分离的基本原理（1）分配系数：溶质在固定相与流动相（2）阻滞因子Rf定义：阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相Kd=0）的迁移率之比

意义：在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小11/17/202211（2）阻滞因子Rf11/11/2022115.2色谱图及基本概念（1）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱进入监测器，监测器的响应信号－时间（或流动相体积）曲线，称为色谱图或色谱流出曲线。（2）基线：在操作条件下，色谱柱出口没有组分流出，仅有流动相流过监测器，此时流出的曲线。（3）色谱峰：当样品中的组分随流动相流入监测器时，监测器的响应信号随时间变化所形成的峰形图形。（4）峰形：对称于峰尖的正态分布曲线。11/17/2022125.2色谱图及基本概念（1）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分洗脱曲线返回11/17/202213洗脱曲线返回11/11/202213（5）洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异11/17/202214（5）洗脱体积11/11/202214（6）保留值保留值：混合物中各组分在色谱柱中停留的时间或将组分带出色谱柱所需流动相体积的数值保留时间（tR）：从开始进样至出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。死时间（t0）：不被固定相滞留的组分（空气等），从开始进样至出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。校正保留时间（tR’）：扣除死时间后的保留时间。（tR’＝tR-

t0）保留体积（VR）、死体积（V0）、校正保留体积（VR’）相对保留值（r2，1）：在相同操作条件下，待测组分与参比组分的校正保留值之比。11/17/202215（6）保留值保留值：混合物中各组分在色谱柱中停留的时间或将组

(7)分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰峰底宽度平均值之比。峰宽（W）：两侧拐点处所作的切线与峰底相交于两点，此两点的距离。（见图）半高峰宽（W1/2)：1/2峰高处的峰宽。峰高：峰顶点与峰底的垂直距离。峰面积：峰与峰底之间的面积。标准偏差（σ）：0.607h峰高处的峰宽的1/2区域宽度（峰宽、半高峰宽、标准偏差）W=4σ

R≥1完全分离11/17/202216(7)分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰峰底宽度（8）色谱柱的理论塔板：流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高（塔板高度）反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N---理论塔板数tR---保留时间W1/2---半峰宽Wb---峰底宽度理论塔板高度：HL---柱长11/17/202217（8）色谱柱的理论塔板：流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的6.色谱分离操作（1）装柱（2）上样（3）淋洗（4）洗脱方法按操作方式a恒定洗脱b分步洗脱c梯度洗脱按洗脱机理专一性洗脱（specificelution）非专一性洗脱（nonspecificelution）11/17/2022186.色谱分离操作（1）装柱11/11/20221811/17/20221911/11/202219（1）装柱装柱的质量直接影响到分离的效果，因而装柱是分离成功的最关键的一步。目前，装柱的方式主要采用自然沉降法、加压法等。11/17/202220（1）装柱装柱的质量直接影响到分离的效果，因而装自然沉降法装柱的要点1.先在柱内注入约1/3柱高的起始缓冲液，并排除好气泡；2.将填充层析介质慢慢地、连续不断地添加到装有缓冲液的柱中，确保装柱均匀、不断层、无气泡；3.控制好流速和操作压，出水口不能降得太低；4.层析柱一定要垂直，以免填充层析介质歪斜；5.在柱的表面始终要保持一层溶剂，不能“流干”；6.添加的填充层析介质不宜过稀；7.装好柱后，应在柱的表面放一张滤纸片、尼龙纱或人造丝网11/17/202221自然沉降法装柱的要点1.先在柱内注入约1/3柱高的起始缓冲液（2）平衡平衡：用起始缓冲液溶液流经（浸泡）层析介质，使层析介质颗粒四周和内部处于相同pH和离子强度状态的过程。层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pH和离子强度一般用起始缓冲溶液在恒定压力下走柱平衡液用量一般为相当于3~5倍床体积，使层析介质充分平衡、柱床稳定11/17/202222（2）平衡平衡：用起始缓冲液溶液流经（浸泡）层析（3）上样上样量的多少和上样体积大小是影响分离效果的关键因素。上样量越少和上样体积越小，则分离效果越好最大上样量必须在具体实验条件下通过反复实验来确定11/17/202223（3）上样上样量的多少和上样体积大小是影响分离效果样品的制备样品在上柱前必须经过预处理：一般要使其与起始缓冲液有相同的pH值、离子强度和尽可能小的体积预处理方法：常用超滤法、透析法和凝胶过滤法等进行浓缩和脱盐，样品中的不容物在上样前用离心法或过滤法除去。11/17/202224样品的制备样品在上柱前必须经过预处理：一般要使其与起加样方法移去柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液管加样：先使移液管尖端接触离柱床表面约1cm高出的内壁，随后随沿柱内壁转动一周，然后迅速移至中央，使样品尽可能快地覆盖住全胶面，打开下口，以便使样品均匀地渗入柱内，当样品液下降至胶面相切（胶面必须覆盖一层薄薄的溶液）时，关闭下口。用蠕动泵把样品直接传送到柱表面（适用于添加大量样品或工业生产上）加样后，即开始收集流出液体。样液完全流入层析柱后，用起始缓冲液装满柱，再接恒流泵开始洗脱11/17/202225加样方法移去柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液（4）洗脱先用足够量的起始缓冲液流洗层析柱，洗出未被吸附的物质，并使床体得到充分平衡然后，在用适当的洗脱液进行洗脱，以达到分离的目的洗脱液的pH及离子强度等是影响分离效果、产品质量和数量的重要因素，故不同物质应选用不同的洗脱液11/17/202226（4）洗脱先用足够量的起始缓冲液流洗层析柱，洗出未洗脱操作方式可连接恒流泵和收集器，全自动进行洗脱与收集也可以利用自然压力，人工操作进行洗脱与收集11/17/202227洗脱操作方式可连接恒流泵和收集器，全自动进行洗洗脱方式通常采用的洗脱方式有两种：阶段洗脱法和连续梯度洗脱法11/17/202228洗脱方式通常采用的洗脱方式有两种：阶段洗脱法和阶段洗脱法又称逐次洗脱法，是指分段改变洗脱液中的pH值或盐浓度，使吸附在柱上的各组分洗脱下来。当欲分离纯化的混合物组成简单，或分子量及性质差别较大，或需要快速分离时，阶段洗脱是比较实用但这种方法有以下缺点：洗脱能力较强，分辨率较差，亲和力或分子量相近的不同组分不易分开，可能集中组分将出现在同一个洗脱峰中，不能分开。易形成拖尾现象11/17/202229阶段洗脱法又称逐次洗脱法，是指分段改变洗脱液中连续梯度洗脱又称线性梯度洗脱法，是通过连续改变洗脱液中的pH值或盐浓度，使吸附柱上的各组分被洗脱下来通常采用一种低浓度的盐溶液为起始溶液，另一种高浓度的盐溶液作为最终溶液。两者之间通过一根玻璃管连通，使高盐溶液向低盐溶液处流，起始溶液直接流入柱内，这样就使柱内的盐浓度梯度上升，克服了直线洗脱中的拖尾现象。它的分辨率大大超过分段洗脱。在生化试验及生化物质制备中常用连续梯度洗脱，它优于阶段洗脱法。11/17/202230连续梯度洗脱又称线性梯度洗脱法，是通过连续改变常用的梯度混合器由2个容器构成2个容器安放在同一个水平上，第一个容器盛有起始缓冲液，第二个容器盛有等量的、含较高离子强度或不同pH值的上限缓冲液，二者用管子相连，以保持其中溶液的流动静力平衡。第一个容器通过管道与柱相连，当缓冲液从第一个容器流入柱中时，第二个容器的缓冲液自动地来补足，结果使洗脱液的pH值、离子强度呈线性地增加。11/17/202231常用的梯度混合器由2个容器构成2个容器安放在同（5）流速控制流速与所用介质的结构、粗细及数量有关，与层析柱大小、介质填装的松紧、洗脱液的粘度、操作压等也有关，必须根据具体条件反复试验，以确定一个合适的流速。流速控制方法有两种：流速可以通过调价“操作压”或恒流泵的速度来控制。“操作压”相当于在柱上部的储液瓶中溶剂的水平和柱出水口位置的水平之差，可以用装有恒压管的恒压瓶，使操作压保持恒定。利用恒流泵通过固定流速把洗脱液泵入或泵出柱，并保持稳定流速。11/17/202232（5）流速控制流速与所用介质的结构、粗细及数量有（6）分部收集洗脱液必须分成小部分收集。每管收集的体积愈小，愈容易得到纯的组分。收集时，现多使用自动部分收集器进行。11/17/202233（6）分部收集洗脱液必须分成小部分收集。每管收（7）洗脱峰检测为了测定收集的各部分中各种成分的分布，必须用一些能特异地检测被分离化合物的方法来进行分析，一般可用直接或间接方法，主要取决于溶质的性质和层析目的。直接法有分光光度法、光折射法、荧光法和放免法等11/17/202234（7）洗脱峰检测为了测定收集的各部分中各种成分（8）合并收集欲得到高纯度的化合物，一般根据洗脱峰的位置收集合并较窄的部分；欲得产量较多目的物，则合并较宽部分。11/17/202235（8）合并收集欲得到高纯度的化合物，一般根据洗（9）脱盐和浓缩在科研、生产中，要得到高纯度的组分，往往要经过几次柱层析，每次柱层析后，某一峰的洗脱液可依次用透析法除盐、超滤或减压薄膜浓缩法将样品浓缩到一定体积后，再上第二次柱。上第三次柱前也可采用类似的方法处理样品11/17/202236（9）脱盐和浓缩在科研、生产中，要得到高纯度的11/17/20223711/11/20223711/17/20223811/11/20223811/17/20223911/11/202239第二节吸附色谱法1.基本概述:1.1吸附定义：吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。（表面吸附与吸收）1.2吸附作用：脱色、除臭、吸湿、防潮、及某些产品（如：酶、蛋白质、核苷酸、氨基酸、抗生素等）的分离精制。11/17/202240第二节吸附色谱法1.基本概述:11/11/2022401.3吸附的特点：①选择性高②处理能力较低③可直接分离发酵液中所需的产物④操作简单，但实验设计复杂。11/17/2022411.3吸附的特点：11/11/2022411.4分类：柱色谱和薄层色谱1.5分配系数（K）与迁移率（Rf）关系

K大，Rf小；K小，Rf大1.6方式：静态吸附与动态吸附11/17/2022421.4分类：柱色谱和薄层色谱11/11/2022422吸附过程的理论基础2.1基本概念吸附：利用吸附剂对液体或气体中某些组分具有选择性吸附能力，使其富集在吸附剂表面的过程。吸附物：被吸附的物质。吸附剂：吸附操作所使用的固体原料。一般为多孔微粒或多孔膜，具有很大比表面积。原因：固体内部分子作用力＝0固体分子外部作用力≠0，即从外界吸附分子、离子原子，并在吸附表面形成单分子或多分子层。11/17/2022432吸附过程的理论基础2.1基本概念11/11/2022432.2吸附原理（1）作用力：吸附剂与吸附质间的范德华力（定向力、诱导力、色散力）或氢键。（2）吸附力大小：吸附质能否被吸附及吸附量多少a.溶质与吸附剂极性的相似性b.溶剂极性与溶质极性的相似性11/17/2022442.2吸附原理（1）作用力：吸附剂与吸附质间的范德华力（定2.3影响吸附的因素（1）吸附剂的性质：影响吸附容量和吸附速率a.吸附剂表面积b.吸附剂孔径-适中c.极性：极性化合物选极性吸附剂；非极性化合物选非极性吸附剂。（2）吸附质性质a.溶质从较易溶解的溶剂中被吸附时，吸附量较少（相似相容）b.极性被吸附物质吸附剂溶剂极性极性非极性非极性非极性极性11/17/2022452.3影响吸附的因素被吸附物质吸附剂溶剂极性极性非极性非极c.同系物：分子量越大，极性越低，易被非极性吸附剂吸附如：活性炭：W大＞W小；多肽＞氨基酸；多糖＞单糖(3)其他因素：T、pH、吸附质浓度、吸附剂用量等

11/17/202246c.同系物：分子量越大，极性越低，易被非极性吸附剂吸附112.4常用吸附剂2.4.1活性炭（非极性吸附剂）（1）种类：

活性炭种类颗粒大小表面积吸附力吸附量洗脱粉末活性炭小大大大难颗粒活性炭大小较小较小较难锦纶活性炭较小较大小小易11/17/2022472.4常用吸附剂2.4.1活性炭（非极性吸附剂）活性炭种类（2）活性炭对物质的吸附一般规律a.吸附作用：在水中吸附力最强，在有机溶剂中吸附力最弱b.洗脱作用：水的洗脱能力最弱，有机溶剂洗脱能力最强c.被分离物类型：W大＞W小；芳香族＞脂肪族d.pH值的影响应用：精制有机物常用活性炭脱色；高纯金属微量杂质的分离分析。11/17/202248（2）活性炭对物质的吸附一般规律应用：精制有机物常用活性炭脱2.4.2硅胶－极性吸附剂（1）影响吸附的因素a.吸附物的性质：极性化合物＞非极性化合物b.硅胶含水量（1－20％）（2）硅胶活化：105－110℃活化1h

11/17/2022492.4.2硅胶－极性吸附剂11/11/2022492.4.3大孔性吸附树脂（1）大孔性树脂的结构大孔吸附树脂是一种不含交换基团的,具有大孔结构的高分子吸附剂。通常大孔性树脂是聚苯乙烯和二乙烯苯的共聚物，它们具有多孔性的巨大网状结构。11/17/2022502.4.3大孔性吸附树脂（1）大孔性树脂的结构11/11/2(2)大孔网状吸附树脂的种类非极性吸附树脂：苯乙烯交联而成，又称芳香族吸附剂。中等极性吸附树脂：甲基丙烯酸酯交联而成，交联剂亦为甲基丙烯酸酯，故又称脂肪族吸附剂。极性吸附剂：丙烯酰胺或亚砜经聚合而成，通常含有硫氧、酰胺、氮氧等基团。11/17/202251(2)大孔网状吸附树脂的种类非极性吸附树脂：苯乙烯交联而成，（3）吸附原则a.吸附剂的极性非极性吸附剂适应从极性溶剂中吸附非极性物极性吸附剂适应从非极性溶剂中吸附极性物质b.吸附物分子大小－吸附剂孔径（孔径＝吸附物分子直径的6倍）11/17/202252（3）吸附原则11/11/2022522.吸附薄层色谱2.1基本原理利用吸附剂对样品中各成分的吸附能力不同，及展开剂对他们的解析能力不同，使各成分达到分离。如硅胶薄层层析分离叶绿素或糖2.2吸附薄层色谱条件的选择（1）固定相的选择-种类与颗粒度（2）展开剂的选择-极性11/17/2022532.吸附薄层色谱2.1基本原理11/11/202253展开剂选择的原则：（1）要求Rf：0.2-0.8（2）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小（3）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力。因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果。11/17/202254展开剂选择的原则：（1）要求Rf：0.2-0.811/11/2.3吸附薄层色谱--操作制板：硅胶G板，硅胶CMC板点样：少量多次、D＜3mm、边1.5－2cm展开：密闭容器、提前配好展开剂；溶剂不能浸没样品点；展完后划前沿及样品移动距离检测：紫外线照射；喷雾显色；碘蒸汽等计算Rf-影响因素11/17/2022552.3吸附薄层色谱--操作制板：硅胶G板，硅胶CMC板11/2.4薄层色谱的应用定性分析纯度鉴定样品制备分离纯化11/17/2022562.4薄层色谱的应用定性分析11/11/2022563.吸附柱色谱3.1基本原理3.2吸附柱色谱条件（1）色谱柱的选择a.平直、均匀；D：L＝1：10－40；砂芯或玻璃棉b.分辨率低，选长柱；D大，L大（2）吸附剂的选择-分辨率高（对不同的物质有不同的吸附与解吸能力）如：极性吸附剂易吸附极性化合物；但便于解吸，极性化合物，应选择极性较小的吸附剂11/17/2022573.吸附柱色谱3.1基本原理11/11/202257（3）洗脱剂的选择（1）原则纯度高、稳定性好、对样品溶解度大，易与其它组分分开（2）常用硅胶、氧化铝：洗脱剂极性小→极性大活性炭或非极性大孔树脂：洗脱剂极性大→极性小羟基磷灰石（吸附蛋白质）：盐缓冲液洗脱11/17/202258（3）洗脱剂的选择11/11/20225811/17/20225911/11/20225911/17/20226011/11/20226011/17/20226111/11/20226111/17/20226211/11/20226211/17/20226311/11/20226311/17/20226411/11/20226411/17/20226511/11/20226511/17/20226611/11/202266第三节离子交换色谱原理：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法11/17/202267第三节离子交换色谱原理：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的③离子交换层析原理StartingconditionsAdsorptionsonsamplesubstancesStartofdesorptionEndofdesorptionregenerations①②④⑤11/17/202268③离子交换层析原理StartingconditionsAd1.基本概述1.1离子交换树脂的结构在水溶液中呈不溶解状态，能释放反离子，同时也可与溶液中其它带相反电荷物质结合。如：RSO3Na，DEAE－纤维素（1）基质：具有三维空间立体结构的网络骨架（2）功能基团（或活性基团）：联接在骨架（3）反离子（活性离子）：活性基团所带的相反电荷的活性离子（可交换离子）11/17/2022691.基本概述11/11/2022691.2离子交换的分类1.2.1按活性基团分类，可分为（1）阳离子交换树脂（含酸性基团）强酸性阳离子交换树脂：a.活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）b.pH1－14使用，选择性差弱酸性阳离子交换树脂：a.活性基团有-COOH,-OCH2COOH,C6H5OH等弱酸性基团；b.pH大于7，选择性好11/17/2022701.2离子交换的分类1.2.1按活性基团分类，可分为11/1（2）阴离子交换树脂（含碱性基团）。

强碱性阴离子交换树脂：a活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-ß-羟基乙基胺基；b.pH1－14，选择性差，应用广泛弱碱性阴离子交换树脂：a.活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；b.pH小于7，选择性好，应用范围窄11/17/202271（2）阴离子交换树脂（含碱性基团）。11/11/20227以上为4种基本类型，可通过转型成其它类型R-SO3-H+

→R-SO3-Na+R-COOH→R-COO-Na+R-NR3+OH-→R-NR3+Cl-R-NH3+OH-→R-NH3+Cl-11/17/202272以上为4种基本类型，可通过转型成其它类型R-SO3-H+类型结构活性机团使用pH值商品号强酸型交联的聚苯乙烯－SO3H（磺酸基）0~14国产#732Amberlite1R-120(美)Dowex50(美)Zerolit225(英)神胶1号（日）弱酸型聚丙烯酸－COOH（羧基）－OH（酚羟基）不能小4不能小于9.5国产#724几种离子交换树脂11/17/202273类型结构活性机团使用pH值商品号强酸型交联的聚苯乙烯－SO3几种离子交换树脂类型结构活性基团使用pH值商品号强碱型交联的聚苯乙烯－N（CH3）3Cl（磺酸基）0~14国产#717国产#201Amberlite1RA-400（410）(美)Dowex50(美)Zerolit225(英)神胶801（日）弱碱型交联的聚苯乙烯－NH（CH3）2OH－NH2（CH3）OH0~7国产#704和#330Amberlite1R-45（410）(美)Dowex3(美)ZerolitH11/17/202274几种离子交换树脂类型结构活性基团使用1.2.2新型离子交换树脂大孔离子交换树脂大孔离子交换树脂具有和大孔吸附剂相同的骨架结构，在大孔吸附剂合成后（加入致孔剂），再引入化学功能基团，便可得到大孔离子交换树脂11/17/2022751.2.2新型离子交换树脂大孔离子交换树脂11/11/2021.2.3其它离子交换树脂类型两性树脂：均孔型离子交换树脂：螯合树脂：*多糖基离子交换树脂：11/17/2022761.2.3其它离子交换树脂类型两性树脂：11/11/2022主要的多糖基离子交换树脂（1）离子交换纤维素 a.树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类b.特点：骨架松散、亲水性强，易吸收大分子；表面积大、交换容量大；吸附力弱、交换和洗脱条件温和；分辨率高c.常用的离子交换纤维素：甲基磺酸纤维素（SM－C）、羧甲基纤维素（CM－C）、二乙基氨基乙基纤维素（DEAE－C）、TEAE－C11/17/202277主要的多糖基离子交换树脂（1）离子交换纤维素11/11/20（2）葡聚糖凝胶离子交换树脂a.骨架为葡聚糖凝胶，如sepharose、sephadex，根据功能基团的不同，亦可分为阳离子交换和阴离子交换树脂b.特点：除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高了分离的效率c.常用的葡聚糖凝胶离子交换树脂：CM-sephadexC-25、DEAE-sephadexA-25等11/17/202278（2）葡聚糖凝胶离子交换树脂11/11/202278PS：（1）离子交换树脂：适用于无机离子交换和有机酸、aa、抗生素等小分子的提取、分离（2）蛋白质类生物大分子－多糖基离子交换剂a.亲水性强－提供微环境b.孔径较大－提高实际交换容量c.粒度较小－增加扩散，减小阻力d.电荷密度较低－静电作用小，避免失活；易洗脱11/17/202279PS：11/11/2022792.离子交换树脂的理化性能外观：球形、浅色为宜，粒度大小为16~60目>90%；机械强度：>90%；含水量：0.3-0.7g/g树脂；交换容量：重量交换容量、体积交换容量、工作交换容量或称表观交换容量（在某一条件下）；稳定性：化学稳定性、热稳定性；膨胀度：交联度、活性基团的性质与数量、活性离子的性质、介质的性质和浓度、骨架结构；11/17/2022802.离子交换树脂的理化性能外观：球形、浅色为宜，粒度大小为13.离子交换分离的理论基础

（1）A+自溶液中扩散到树脂表面（2）A+从树脂表面进入树脂内部的活性中心（3）A+与RB在活性中心上发生复分解反应（4）解吸附离子B+自树脂内部扩散至树脂表面（5）B+离子从树脂表面扩散到溶液中交换速度的控制步骤是扩散速度，不同的分离体系可能由内部扩散或外部扩散控制3.1离子交换过程11/17/2022813.离子交换分离的理论基础

（1）A+自溶液中扩散到树脂表面3.2离子交换

离子交换树脂与含离子的溶液接触时，树脂上的反离子A+进入溶液，而溶液中的B+被树脂“吸附”，即“化学吸附”。（1）反应可逆，平衡可迅速达到，且平衡移动遵守质量作用定律。如：B+浓度增加，平衡右移（2）离子交换树脂的选择性－对溶液中不同离子具有不同结合力选择性系数：

11/17/2022823.2离子交换（1）反应可逆，平衡可迅速达到，且平衡移动遵守3.3离子交换的选择性（1）离子交换常数：交换势或交换系数[R-A]、[R-B]表示结合在树脂上的A离子和B离子浓度[A]S、[B]S表示溶液中A离子和B离子越大B越易被交换11/17/2022833.3离子交换的选择性（1）离子交换常数：交换势或交换系数[（2）影响离子交换选择性的因素a.水合离子半径：半径越小，亲和力越大；b.离子化合价：高价离子易于被吸附；c.溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量；d.离子强度：越低越好；e.有机溶剂：不利于吸附；f.交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少；g.树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；11/17/202284（2）影响离子交换选择性的因素a.水合离子半径：半径越小，亲对于强酸型阳离子交换树脂，当与金属离子M+接触时:

选择性系数值的大小表示树脂对金属离子M+的亲和力的大小，它与树脂的类型、离子的性质与浓度以及溶液的组成有关。

为什么金属离子(Na+、K+等)可以吸附在H-型强酸型阳离子交换柱上，而后又可以用HCl来再生强酸型阳离子交换柱?11/17/202285对于强酸型阳离子交换树脂，当与金属离子M+接触时:选择性系

实验表明，在常温下，当离子浓度不大时，强酸型阳离子交换树脂树脂亲和力大小有如下一些规律。(1)金属离子的价数增大，亲和力增大。如Na+<Ca2+<Al3+<Th4+(2)离子价数相同时，亲和力大小随着水合离子半径的减少而增大。如1价离子：Li+<H+<Na+<NH4+<K+<Rb+<Cs+<Tl+<Ag+；2价离子：Mg2+<Zn2+<Co2+<Cu2+<Cd2+<Ni2+<Ca2+<Sr2+<Pb2+<Ba2+。11/17/202286实验表明，在常温下，当离子浓度不大时，强酸型阳离子交4.离子交换柱层析操作树脂的选择树脂的预处理及转型装柱及平衡（要保持均匀、无气泡和断层上样吸附：洗涤与洗脱：改变pH或离子强度11/17/2022874.离子交换柱层析操作树脂的选择11/11/2022874.1树脂的选择（1）树脂基本要求：交换容量大、选择性好、物理化学性质稳定、机械强度好等（2）树脂类型的选择①阴、阳离子交换树脂的选择－－被分离物所带的电荷情况及稳定性a.（+）－阳b.（-）－阴11/17/2022884.1树脂的选择（1）树脂基本要求：11/11/202288②－目的物酸碱性、树脂离解状态及选择性、洗脱a.目的物具有较强的酸（或碱）性－－选弱碱（酸）性阴（或阳）离子交换树脂b.目的物具有较弱的酸（或碱）性－－选强碱（酸）性阴（或阳）离子交换树脂c.生物样品习惯采用弱性树脂d.强树脂，选择性小，应用广泛；弱树脂，选择性好，应用窄11/17/202289②－目的物酸碱性、树脂离解状态及选择性、洗脱a.目的物具有较③离子交换树脂－反离子的选择

－－取决于结合力、实际需求阳离子－Na+、H+、NH4+；阴离子－Cl-、OH-、一般来说：a.强阳离子交换树脂－Na+、H+

弱阳离子交换树脂－Na+b.强阴离子交换树脂－Cl-、OH-弱阴离子交换树脂－Cl-如：去水中Ca2+链霉素（为一强碱性生物活性药物，pH4-5稳定）－弱阳离子交换树脂－Na+、中性溶液中吸附、酸溶液洗脱11/17/202290③离子交换树脂－反离子的选择

－－取决于结合力、实际需求阳离4.2树脂预处理及转型物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒；化学处理：转型（氢型或钠型）阳离子树脂酸—碱—酸阴离子树脂碱—酸—碱最后以去离子水或缓冲液平衡11/17/2022914.2树脂预处理及转型物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度4.3上样吸附选择性吸附（目的物结合力大，杂质结合力小）a.使目的物带上与反离子同类型的电荷且数量大b.使杂质带上与反离子相反的电荷或不带电。11/17/2022924.3上样吸附选择性吸附（目的物结合力大，杂质结合力小）114.4洗涤和洗脱洗涤－除杂洗脱－离子交换完成后，将树脂吸附的物质重新转入溶液的方法洗脱方法（1）改变溶液pH值（2）改变溶液离子强度洗脱方式：阶段洗脱与梯度洗脱；动态与静态洗脱11/17/2022934.4洗涤和洗脱洗涤－除杂11/11/202293恒定洗脱11/17/202294恒定洗脱11/11/202294分步洗脱11/17/202295分步洗脱11/11/202295(c)梯度洗脱11/17/202296(c)梯度洗脱11/11/202296

洗脱一般采取分步淋洗或梯度淋洗，其中分步洗脱，是指先采用洗脱能力较弱的溶液，使易洗脱组分流出，然后依次使用洗脱能力更强的溶液，洗脱较难洗脱的组分。11/17/202297洗脱一般采取分步淋洗或梯度淋洗，其中4.5树脂再生（1）定义：是指使离子交换树脂重新具有交换能力的过程（2）方法：酸性阳离子树脂酸-碱-酸-缓冲溶液淋洗碱性阴离子树脂碱-酸-碱-缓冲溶液淋洗（3）方式有：顺流再生和逆流再生11/17/2022984.5树脂再生（1）定义：11/11/2022984.6离子交换应用实例离子交换法提取蛋白质、氨基酸水处理（软水、去离子水的制备）抗生素的提取肝素的提取11/17/2022994.6离子交换应用实例离子交换法提取蛋白质、氨基酸11/11(1)水的净化—脱盐11/17/2022100(1)水的净化—脱盐11/11/2022100(2)氨基酸的分离

采用交换树脂为Dowo×50,柱长100cm，柱径0.9cm，Na+型树脂淋洗剂采用pH值逐步提高的柠檬酸钠缓冲液。

（其中Asp天冬氨酸，Thr苏氨酸，Ser丝氨酸，Glu谷氨酸，Pro脯氨酸，Gly甘氨酸，Ala丙氨酸，Cys-Cys胱氨酸，Val缬氨酸，Met蛋氨酸，Ile异亮氨酸，Leu亮氨酸，Tyr酪氨酸，Phe苯丙氨酸，His组氨酸，Lys赖氨酸，Arg精氨酸。）11/17/2022101(2)氨基酸的分离采用交换树脂为Do氨基酸分离的淋洗曲线11/17/2022102氨基酸分离的淋洗曲线11/11/2022102“离子交换树脂之父”何炳林1942年毕业于西南联合大学1952年获美国印第安纳大学博士学位南开大学教授1980年当选为中国科学院院士开创并发展了我国的离子交换树脂和吸附工业，发明了大孔离子交换树脂，系统研究了新型离子交换树脂和大孔新型吸附树脂的合成、结构、性质及应用。11/17/2022103“离子交换树脂之父”何炳林1942年毕业于西南联合大学11/第四节凝胶过滤①原理：凝胶过滤所用的基质具有立体网状结构，筛孔直径一致，且呈珠装颗粒物质，这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自由扩散和渗透。因此，混合物分子大小不同，通过介质所需阻力不同，从而被分离。流出顺序：大分子→中等分子→小分子11/17/2022104第四节凝胶过滤①原理：11/11/202210411/17/202210511/11/2022105在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离②优点：

操作简便 分离效果好，重复性高，回收率高 分离条件温和，不会使物质变性 凝胶不用再生，可反复使用缺点：分离速度较慢、选择性低（仅分子量大小）、料液处理量少11/17/2022106在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同④凝胶过滤介质葡聚糖凝胶（sephadex）由葡聚糖+环氧氯丙烷交联而成sephadexG1015255075100200琼脂糖凝胶（Sepharose）－天然凝胶Sepharose2B4B聚丙烯酰胺凝胶（Bio－Gel）Bio－Gelp2p4p100等（编号×100为排阻现）疏水性凝胶应用：分离、浓缩；脱盐；测定分子量11/17/2022107④凝胶过滤介质葡聚糖凝胶（sephadex）11/11/20第五节亲和色谱

利用高分子化合物可以和与它们相对应的配基，进行特异并可逆结合的特点来进行分离的，把相应的一对配基中的一个通过物理吸附或化学共价键作用，固定在载体上使它变成固相，装在层析柱中来提纯其相对应的配基。11/17/2022108第五节亲和色谱利用高分子化合物可以和与它11/17/202210911/11/20221091.2.4纯化与精制-色谱技术概述吸附色谱离子交换色谱凝胶过滤亲和色谱11/17/20221101.2.4纯化与精制-色谱技术概述11/11/20221第一节色谱分离技术概述1.色谱技术概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同，经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。2.特点：（1）

纯化倍数高（2）操作规模小，放大困难（3）

终产品纯化（4）适用于价格昂贵的产品11/17/2022111第一节色谱分离技术概述1.色谱技术概念：色谱技术是一组相关3.色谱系统的基本组成11/17/20221123.色谱系统的基本组成11/11/20223PharmaciaÄKTA层析系统11/17/2022113PharmaciaÄKTA层析系统11/11/211/17/202211411/11/202254.色谱的分类（1）根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类凝胶色谱亲和色谱离子交换色谱分离法吸附色谱法分配色谱法11/17/20221154.色谱的分类（1）根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的（2）根据固定相的形状不同的分类：

柱色谱法薄层色谱法11/17/2022116（2）根据固定相的形状不同的分类：柱色谱法薄层色谱法11/（3）根据流动相的物态不同的分类：

液相色谱（LC）：LLC、LSC反相色谱：固定相极性小于流动相（4）根据流动相与固定相的极性分类：

正相色谱：固定相极性大于流动相气相色谱（GC）：GLC、GSC11/17/2022117（3）根据流动相的物态不同的分类：液相色谱（LC）：LL5.色谱分离的基本原理任何色谱分离过程实质上都是溶质随流动相流动而迁移的过程，不同溶质在流动相和固定相中的分配比例不同，因而随流动相迁移的速度不同，从而使不同物质分离开来。11/17/20221185.色谱分离的基本原理任何色谱分离过程实质上都是溶质随流动相5.1色谱分离的基本原理（1）分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值可由Langmuir方程得出Kd---分配系数q、c---溶质在固相和液相中的浓度11/17/20221195.1色谱分离的基本原理（1）分配系数：溶质在固定相与流动相（2）阻滞因子Rf定义：阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相Kd=0）的迁移率之比

意义：在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小11/17/2022120（2）阻滞因子Rf11/11/2022115.2色谱图及基本概念（1）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱进入监测器，监测器的响应信号－时间（或流动相体积）曲线，称为色谱图或色谱流出曲线。（2）基线：在操作条件下，色谱柱出口没有组分流出，仅有流动相流过监测器，此时流出的曲线。（3）色谱峰：当样品中的组分随流动相流入监测器时，监测器的响应信号随时间变化所形成的峰形图形。（4）峰形：对称于峰尖的正态分布曲线。11/17/20221215.2色谱图及基本概念（1）色谱图：混合液中各组分经色谱柱分洗脱曲线返回11/17/2022122洗脱曲线返回11/11/202213（5）洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异11/17/2022123（5）洗脱体积11/11/202214（6）保留值保留值：混合物中各组分在色谱柱中停留的时间或将组分带出色谱柱所需流动相体积的数值保留时间（tR）：从开始进样至出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。死时间（t0）：不被固定相滞留的组分（空气等），从开始进样至出口处被测组分出现浓度最大值所需要的时间。校正保留时间（tR’）：扣除死时间后的保留时间。（tR’＝tR-

t0）保留体积（VR）、死体积（V0）、校正保留体积（VR’）相对保留值（r2，1）：在相同操作条件下，待测组分与参比组分的校正保留值之比。11/17/2022124（6）保留值保留值：混合物中各组分在色谱柱中停留的时间或将组

(7)分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰峰底宽度平均值之比。峰宽（W）：两侧拐点处所作的切线与峰底相交于两点，此两点的距离。（见图）半高峰宽（W1/2)：1/2峰高处的峰宽。峰高：峰顶点与峰底的垂直距离。峰面积：峰与峰底之间的面积。标准偏差（σ）：0.607h峰高处的峰宽的1/2区域宽度（峰宽、半高峰宽、标准偏差）W=4σ

R≥1完全分离11/17/2022125(7)分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组色谱峰峰底宽度（8）色谱柱的理论塔板：流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高（塔板高度）反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N---理论塔板数tR---保留时间W1/2---半峰宽Wb---峰底宽度理论塔板高度：HL---柱长11/17/2022126（8）色谱柱的理论塔板：流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的6.色谱分离操作（1）装柱（2）上样（3）淋洗（4）洗脱方法按操作方式a恒定洗脱b分步洗脱c梯度洗脱按洗脱机理专一性洗脱（specificelution）非专一性洗脱（nonspecificelution）11/17/20221276.色谱分离操作（1）装柱11/11/20221811/17/202212811/11/202219（1）装柱装柱的质量直接影响到分离的效果，因而装柱是分离成功的最关键的一步。目前，装柱的方式主要采用自然沉降法、加压法等。11/17/2022129（1）装柱装柱的质量直接影响到分离的效果，因而装自然沉降法装柱的要点1.先在柱内注入约1/3柱高的起始缓冲液，并排除好气泡；2.将填充层析介质慢慢地、连续不断地添加到装有缓冲液的柱中，确保装柱均匀、不断层、无气泡；3.控制好流速和操作压，出水口不能降得太低；4.层析柱一定要垂直，以免填充层析介质歪斜；5.在柱的表面始终要保持一层溶剂，不能“流干”；6.添加的填充层析介质不宜过稀；7.装好柱后，应在柱的表面放一张滤纸片、尼龙纱或人造丝网11/17/2022130自然沉降法装柱的要点1.先在柱内注入约1/3柱高的起始缓冲液（2）平衡平衡：用起始缓冲液溶液流经（浸泡）层析介质，使层析介质颗粒四周和内部处于相同pH和离子强度状态的过程。层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pH和离子强度一般用起始缓冲溶液在恒定压力下走柱平衡液用量一般为相当于3~5倍床体积，使层析介质充分平衡、柱床稳定11/17/2022131（2）平衡平衡：用起始缓冲液溶液流经（浸泡）层析（3）上样上样量的多少和上样体积大小是影响分离效果的关键因素。上样量越少和上样体积越小，则分离效果越好最大上样量必须在具体实验条件下通过反复实验来确定11/17/2022132（3）上样上样量的多少和上样体积大小是影响分离效果样品的制备样品在上柱前必须经过预处理：一般要使其与起始缓冲液有相同的pH值、离子强度和尽可能小的体积预处理方法：常用超滤法、透析法和凝胶过滤法等进行浓缩和脱盐，样品中的不容物在上样前用离心法或过滤法除去。11/17/2022133样品的制备样品在上柱前必须经过预处理：一般要使其与起加样方法移去柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液管加样：先使移液管尖端接触离柱床表面约1cm高出的内壁，随后随沿柱内壁转动一周，然后迅速移至中央，使样品尽可能快地覆盖住全胶面，打开下口，以便使样品均匀地渗入柱内，当样品液下降至胶面相切（胶面必须覆盖一层薄薄的溶液）时，关闭下口。用蠕动泵把样品直接传送到柱表面（适用于添加大量样品或工业生产上）加样后，即开始收集流出液体。样液完全流入层析柱后，用起始缓冲液装满柱，再接恒流泵开始洗脱11/17/2022134加样方法移去柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液（4）洗脱先用足够量的起始缓冲液流洗层析柱，洗出未被吸附的物质，并使床体得到充分平衡然后，在用适当的洗脱液进行洗脱，以达到分离的目的洗脱液的pH及离子强度等是影响分离效果、产品质量和数量的重要因素，故不同物质应选用不同的洗脱液11/17/2022135（4）洗脱先用足够量的起始缓冲液流洗层析柱，洗出未洗脱操作方式可连接恒流泵和收集器，全自动进行洗脱与收集也可以利用自然压力，人工操作进行洗脱与收集11/17/2022136洗脱操作方式可连接恒流泵和收集器，全自动进行洗洗脱方式通常采用的洗脱方式有两种：阶段洗脱法和连续梯度洗脱法11/17/2022137洗脱方式通常采用的洗脱方式有两种：阶段洗脱法和阶段洗脱法又称逐次洗脱法，是指分段改变洗脱液中的pH值或盐浓度，使吸附在柱上的各组分洗脱下来。当欲分离纯化的混合物组成简单，或分子量及性质差别较大，或需要快速分离时，阶段洗脱是比较实用但这种方法有以下缺点：洗脱能力较强，分辨率较差，亲和力或分子量相近的不同组分不易分开，可能集中组分将出现在同一个洗脱峰中，不能分开。易形成拖尾现象11/17/2022138阶段洗脱法又称逐次洗脱法，是指分段改变洗脱液中连续梯度洗脱又称线性梯度洗脱法，是通过连续改变洗脱液中的pH值或盐浓度，使吸附柱上的各组分被洗脱下来通常采用一种低浓度的盐溶液为起始溶液，另一种高浓度的盐溶液作为最终溶液。两者之间通过一根玻璃管连通，使高盐溶液向低盐溶液处流，起始溶液直接流入柱内，这样就使柱内的盐浓度梯度上升，克服了直线洗脱中的拖尾现象。它的分辨率大大超过分段洗脱。在生化试验及生化物质制备中常用连续梯度洗脱，它优于阶段洗脱法。11/17/2022139连续梯度洗脱又称线性梯度洗脱法，是通过连续改变常用的梯度混合器由2个容器构成2个容器安放在同一个水平上，第一个容器盛有起始缓冲液，第二个容器盛有等量的、含较高离子强度或不同pH值的上限缓冲液，二者用管子相连，以保持其中溶液的流动静力平衡。第一个容器通过管道与柱相连，当缓冲液从第一个容器流入柱中时，第二个容器的缓冲液自动地来补足，结果使洗脱液的pH值、离子强度呈线性地增加。11/17/2022140常用的梯度混合器由2个容器构成2个容器安放在同（5）流速控制流速与所用介质的结构、粗细及数量有关，与层析柱大小、介质填装的松紧、洗脱液的粘度、操作压等也有关，必须根据具体条件反复试验，以确定一个合适的流速。流速控制方法有两种：流速可以通过调价“操作压”或恒流泵的速度来控制。“操作压”相当于在柱上部的储液瓶中溶剂的水平和柱出水口位置的水平之差，可以用装有恒压管的恒压瓶，使操作压保持恒定。利用恒流泵通过固定流速把洗脱液泵入或泵出柱，并保持稳定流速。11/17/2022141（5）流速控制流速与所用介质的结构、粗细及数量有（6）分部收集洗脱液必须分成小部分收集。每管收集的体积愈小，愈容易得到纯的组分。收集时，现多使用自动部分收集器进行。11/17/2022142（6）分部收集洗脱液必须分成小部分收集。每管收（7）洗脱峰检测为了测定收集的各部分中各种成分的分布，必须用一些能特异地检测被分离化合物的方法来进行分析，一般可用直接或间接方法，主要取决于溶质的性质和层析目的。直接法有分光光度法、光折射法、荧光法和放免法等11/17/2022143（7）洗脱峰检测为了测定收集的各部分中各种成分（8）合并收集欲得到高纯度的化合物，一般根据洗脱峰的位置收集合并较窄的部分；欲得产量较多目的物，则合并较宽部分。11/17/2022144（8）合并收集欲得到高纯度的化合物，一般根据洗（9）脱盐和浓缩在科研、生产中，要得到高纯度的组分，往往要经过几次柱层析，每次柱层析后，某一峰的洗脱液可依次用透析法除盐、超滤或减压薄膜浓缩法将样品浓缩到一定体积后，再上第二次柱。上第三次柱前也可采用类似的方法处理样品11/17/2022145（9）脱盐和浓缩在科研、生产中，要得到高纯度的11/17/202214611/11/20223711/17/202214711/11/20223811/17/202214811/11/202239第二节吸附色谱法1.基本概述:1.1吸附定义：吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。（表面吸附与吸收）1.2吸附作用：脱色、除臭、吸湿、防潮、及某些产品（如：酶、蛋白质、核苷酸、氨基酸、抗生素等）的分离精制。11/17/2022149第二节吸附色谱法1.基本概述:11/11/2022401.3吸附的特点：①选择性高②处理能力较低③可直接分离发酵液中所需的产物④操作简单，但实验设计复杂。11/17/20221501.3吸附的特点：11/11/2022411.4分类：柱色谱和薄层色谱1.5分配系数（K）与迁移率（Rf）关系

K大，Rf小；K小，Rf大1.6方式：静态吸附与动态吸附11/17/20221511.4分类：柱色谱和薄层色谱11/11/2022422吸附过程的理论基础2.1基本概念吸附：利用吸附剂对液体或气体中某些组分具有选择性吸附能力，使其富集在吸附剂表面的过程。吸附物：被吸附的物质。吸附剂：吸附操作所使用的固体原料。一般为多孔微粒或多孔膜，具有很大比表面积。原因：固体内部分子作用力＝0固体分子外部作用力≠0，即从外界吸附分子、离子原子，并在吸附表面形成单分子或多分子层。11/17/20221522吸附过程的理论基础2.1基本概念11/11/2022432.2吸附原理（1）作用力：吸附剂与吸附质间的范德华力（定向力、诱导力、色散力）或氢键。（2）吸附力大小：吸附质能否被吸附及吸附量多少a.溶质与吸附剂极性的相似性b.溶剂极性与溶质极性的相似性11/17/20221532.2吸附原理（1）作用力：吸附剂与吸附质间的范德华力（定2.3影响吸附的因素（1）吸附剂的性质：影响吸附容量和吸附速率a.吸附剂表面积b.吸附剂孔径-适中c.极性：极性化合物选极性吸附剂；非极性化合物选非极性吸附剂。（2）吸附质性质a.溶质从较易溶解的溶剂中被吸附时，吸附量较少（相似相容）b.极性被吸附物质吸附剂溶剂极性极性非极性非极性非极性极性11/17/20221542.3影响吸附的因素被吸附物质吸附剂溶剂极性极性非极性非极c.同系物：分子量越大，极性越低，易被非极性吸附剂吸附如：活性炭：W大＞W小；多肽＞氨基酸；多糖＞单糖(3)其他因素：T、pH、吸附质浓度、吸附剂用量等

11/17/2022155c.同系物：分子量越大，极性越低，易被非极性吸附剂吸附112.4常用吸附剂2.4.1活性炭（非极性吸附剂）（1）种类：

活性炭种类颗粒大小表面积吸附力吸附量洗脱粉末活性炭小大大大难颗粒活性炭大小较小较小较难锦纶活性炭较小较大小小易11/17/20221562.4常用吸附剂2.4.1活性炭（非极性吸附剂）活性炭种类（2）活性炭对物质的吸附一般规律a.吸附作用：在水中吸附力最强，在有机溶剂中吸附力最弱b.洗脱作用：水的洗脱能力最弱，有机溶剂洗脱能力最强c.被分离物类型：W大＞W小；芳香族＞脂肪族d.pH值的影响应用：精制有机物常用活性炭脱色；高纯金属微量杂质的分离分析。11/17/2022157（2）活性炭对物质的吸附一般规律应用：精制有机物常用活性炭脱2.4.2硅胶－极性吸附剂（1）影响吸附的因素a.吸附物的性质：极性化合物＞非极性化合物b.硅胶含水量（1－20％）（2）硅胶活化：105－110℃活化1h

11/17/20221582.4.2硅胶－极性吸附剂11/11/2022492.4.3大孔性吸附树脂（1）大孔性树脂的结构大孔吸附树脂是一种不含交换基团的,具有大孔结构的高分子吸附剂。通常大孔性树脂是聚苯乙烯和二乙烯苯的共聚物，它们具有多孔性的巨大网状结构。11/17/20221592.4.3大孔性吸附树脂（1）大孔性树脂的结构11/11/2(2)大孔网状吸附树脂的种类非极性吸附树脂：苯乙烯交联而成，又称芳香族吸附剂。中等极性吸附树脂：甲基丙烯酸酯交联而成，交联剂亦为甲基丙烯酸酯，故又称脂肪族吸附剂。极性吸附剂：丙烯酰胺或亚砜经聚合而成，通常含有硫氧、酰胺、氮氧等基团。11/17/2022160(2)大孔网状吸附树脂的种类非极性吸附树脂：苯乙烯交联而成，（3）吸附原则a.吸附剂的极性非极性吸附剂适应从极性溶剂中吸附非极性物极性吸附剂适应从非极性溶剂中吸附极性物质b.吸附物分子大小－吸附剂孔径（孔径＝吸附物分子直径的6倍）11/17/2022161（3）吸附原则11/11/2022522.吸附薄层色谱2.1基本原理利用吸附剂对样品中各成分的吸附能力不同，及展开剂对他们的解析能力不同，使各成分达到分离。如硅胶薄层层析分离叶绿素或糖2.2吸附薄层色谱条件的选择（1）固定相的选择-种类与颗粒度（2）展开剂的选择-极性11/17/20221622.吸附薄层色谱2.1基本原理11/11/202253展开剂选择的原则：（1）要求Rf：0.2-0.8（2）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小（3）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力。因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果。11/17/2022163展开剂选择的原则：（1）要求Rf：0.2-0.811/11/2.3吸附薄层色谱--操作制板：硅胶G板，硅胶CMC板点样：少量多次、D＜3mm、边1.5－2cm展开：密闭容器、提前配好展开剂；溶剂不能浸没样品点；展完后划前沿及样品移动距离检测：紫外线照射；喷雾显色；碘蒸汽等计算Rf-影响因素11/17/20221642.3吸附薄层色谱--操作制板：硅胶G板，硅胶CMC板11/2.4薄层色谱的应用定性分析纯度鉴定样品制备分离纯化11/17/20221652.4薄层色谱的应用定性分析11/11/2022563.吸附柱色谱3.1基本原理3.2吸附柱色谱条件（1）色谱柱的选择a.平直、均匀；D：L＝1：10－40；砂芯或玻璃棉b.分辨率低，选长柱；D大，L大（2）吸附剂的选择-分辨率高（对不同的物质有不同的吸附与解吸能力）如：极性吸附剂易吸附极性化合物；但便于解吸，极性化合物，应选择极性较小的吸附剂11/17/20221663.吸附柱色谱3.1基本原理11/11/202257（3）洗脱剂的选择（1）原则纯度高、稳定性好、对样品溶解度大，易与其它组分分开（2）常用硅胶、氧化铝：洗脱剂极性小→极性大活性炭或非极性大孔树脂：洗脱剂极性大→极性小羟基磷灰石（吸附蛋白质）：盐缓冲液洗脱11/17/2022167（3）洗脱剂的选择11/11/20225811/17/202216811/11/20225911/17/202216911/11/20226011/17/202217011/11/20226111/17/202217111/11/20226211/17/202217211/11/20226311/17/202217311/11/20226411/17/202217411/11/20226511/17/202217511/11/202266第三节离子交换色谱原理：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法11/17/2022176第三节离子交换色谱原理：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的③离子交换层析原理StartingconditionsAdsorptionsonsamplesubstancesStartofdesorptionEndofdesorptionregenerations①②④⑤11/17/2022177③离子交换层析原理StartingconditionsAd1.基本概述1.1离子交换树脂的结构在水溶液中呈不溶解状态，能释放反离子，同时也可与溶液中其它带相反电荷物质结合。如：RSO3Na，DEAE－纤维素（1）基质：具有三维空间立体结构的网络骨架（2）功能基团（或活性基团）：联接在骨架（3）反离子（活性离子）：活性基团所带的相反电荷的活性离子（可交换离子）11/17/20221781.基本概述11/11/2022691.2离子交换的分类1.2.1按活性基团分类，可分为（1）阳离子交换树脂（含酸性基团）强酸性阳离子交换树脂：a.活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）b.pH1－14使用，选择性差弱酸性阳离子交换树脂：a.活性基团有-COOH,-OCH2COOH,C6H5OH等弱酸性基团；b.pH大于7，选择性好11/17/20221791.2离子交换的分类1.2.1按活性基团分类，可分为11/1（2）阴离子交换树脂（含碱性基团）。

强碱性阴离子交换树脂：a活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-ß-羟基乙基胺基；b.pH1－14，选择性差，应用广泛弱碱性阴离子交换树脂：a.活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；b.pH小于7，选择性好，应用范围窄11/17/2022180（2）阴离子交换树脂（含碱性基团）。11/11/20227以上为4种基本类型，可通过转型成其它类型R-SO3-H+

→R-SO3-Na+R-COOH→R-COO-Na+R-NR3+OH-→R-NR3+Cl-R-NH3+OH-→R-NH3+Cl-11/17/2022181以上为4种基本类型，可通过转型成其它类型R-SO3-H+类型结构活性机团使用pH值商品号强酸型交联的聚苯乙烯－SO3H（磺酸基）0~14国产#732Amberlite1R-120(美)Dowex50(美)Zerolit225(英)神胶1号（日）弱酸型聚丙烯酸－COOH（羧基）－OH（酚羟基）不能小4不能小于9.5国产#724几种离子交换树脂11/17/2022182类型结构活性机团使用pH值商品号强酸型交联的聚苯乙烯－SO3几种离子交换树脂类型结构活性基团使用pH值商品号强碱型交联的聚苯乙烯－N（CH3）3Cl（磺酸基）0~14国产#717国产#201Amberlite1