TCID50和PFU的换算公式

1、PFU:plaqueformingunit，空斑形成单位：PFU/ml。由pfuTCID50方法来计算病毒的感染单位。TCID50法。2、MOI:multiplicityofinfection，感染复数MOI概念起源于噬菌体感染细菌的争辩。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfunumber/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的争辩中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。MOI产生了不同的含义。能产生pfuMOI的含MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机大事，遵循Poisson分布规律，可计算出感染肯定比例的培育细胞所需的感染复数〔MO其公式为：P=1-P(0),P(0)=e-m或m=-InP〔0。其中：P为被感染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率mMOI值例如，假设要感染培育皿中99%的培育细胞，则：P(0)=1%=0.01m=-In(0.01)=4.6pfu/cell。(一)原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分别病毒克隆。但在实际操作中，常消灭几个病毒颗粒同时感染一个细胞的状况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流淌。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度把握在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观看，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观看，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸取中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。例如，358，接种量0.2ml2.5×10358÷0.2×2.5×103＝7.25×105(PFU/ml)PFUs＝0.7×TCID50的滴度(二)技术应用蚀斑技术可以应用于分别病毒的克隆(无性生殖纯系)定，也可用蚀斑形态和大小争辩病毒的生物学特性。病毒生物学纯化(Virusbiologicalpurification)在进展血清中和试验时,经常会消灭标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性,这种状况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂或者已有很多变异病毒粒子存在其中甚至消灭数量众多的缺陷病毒所致。这时,有必要把手上把握的标准毒株进展纯化,应用病毒蚀斑技术,选择出各个不同的纯化病毒,亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖,测定其滴度,选,必需在掩盖养分琼脂之前用养分液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要把握好稀释的浓度,一个培育瓶中的蚀10个10mm都是安康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此，加了中性红掩盖层的培育物应在暗处培育。蚀斑削减中和试验(PlaqueReductionNeutralizationTest)蚀斑削减中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数削减50％的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒(100PFU),接种预先预备好的单层细胞,再掩盖上养分琼脂置37℃二氧化碳培育箱培育,数天后分别统计蚀斑数,用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。其操作原理与传统的血清中和试验大致一样。〔由于本试验的操作比较繁锁，目前在国内极少应用,国际上也没有把它作为一种各国都承受的诊断方法，仅在OIE国际动物卫生法典(第六版)中列为对裂谷〕(三)操作实例赤羽病病毒(AKV)的滴定或纯化于55mm直径的灭菌塑料培育皿中培育绿猴肾细胞(Vero)，使形成单层。细胞培育3－4天，2000000/ml个细胞？。选取单层细胞全部掩盖，不留有空洞的培育皿用作试验。AKV1010-74℃。3个平皿。接种前弃去细胞培育液,用5mlPBS或细胞培育液冲洗单层细胞,然后弃去冲洗液。每个平皿分别参加0.2ml病毒稀释液，比照组只用细胞培育液代替，置37℃二氧化15分钟摇动一次，以便使病毒均匀分布。4步骤冲洗未被吸附的病毒。21.5％琼脂(预热)7ml，置平372天，平皿需倒置。(8)22％琼脂(预热)5ml，置平台37℃二氧化碳培育箱中培育至次日。结果计算求每组三个培育皿的蚀斑平均数，组间蚀斑数的差异应符合稀释度的规律(10-210010-310个左右)，否则应考虑重试5，即为每毫升病毒原液的蚀斑数。选取特征性的假设干蚀斑，分别以弯头吸管在琼脂层下吸取蚀斑以收获病毒，然后分别接种到预先制备的单层细胞培育瓶中进展增殖或传代。BHK21细胞，可应用于牛流行热病毒(BEFV)。蓝舌病病毒(BTV)血清型鉴定试验(纸片法)抗体纸片制备1×107蚀斑形成单位接种绵羊,3-4周采血分别血清。0.5mm的中性滤纸片，121℃15分种灭菌后保存于枯燥环境。③取上述滤纸片浸入不同血清型的免疫血清后真空冻干,保存于4℃冰箱备用，使用前以灭菌水潮湿。病毒接种6cmBHK21Vero细胞使成单层。103PFU/0.2ml被检蓝舌病病毒接种于细胞上,1h。③洗去未被吸附的病毒，弃去洗液。掩盖琼脂21.57ml，置平台冷却凝固。②在琼脂面上按梅花形图案放上不同型的血清滤纸片,并做好记号。372天。④真空吸出平皿中的滤纸片。⑤取22%5ml37℃二2-3天,待明显蚀斑抑制环消灭。结果判定消灭明显抑制蚀斑形成(即滤纸片位置下仍保持活细胞被染色)的免疫血清即为该被检病毒的血清型。注：本试验方法同时可应用于鹿流行性出血病病毒(EHDV)与蓝舌病病毒(BTV)的鉴别。城疫病病毒(NDV)分别取疑似患病禽的组织用细胞培育液匀浆,离心沉淀后取上清液。16孔微量培育板制备鸡成纤维原代细胞。0.1ml被检病料,372小时后弃残液。1BME40－50℃水浴待用。吸取上述琼脂参加培育板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成掩盖层。3748h。0.0021%BME40－50℃水浴待用。(8)0.5ml，使冷却凝固成其次掩盖层。把培育板倒置，在37℃二氧化碳培育箱连续培育，48小时内观看结果。挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。注：本试验方法在样品中病毒含量少的状况下比单纯用细胞培育分别要敏感。试验用各种成份的配制细胞养分液(用于稀释病毒)：10199保存液：4ml犊牛血清： 0.8ml3%碳酸氢钠： 2.4ml双蒸水： 32.8ml，40ml两倍浓缩细胞养分液(配制首层琼脂用)：10199保存液：20ml犊牛血清： 4ml3％碳酸氢钠：12ml1％二乙氨基乙基(DEAE)：10ml(可选择)双蒸水：54ml，100ml(40－45℃水浴备用)(3)1.5％琼脂：精制琼脂糖：1.5g100ml(0.112MPa1540－45℃水浴备用。)含中性红两倍浓缩细胞养分液(配制其次层琼脂用)：10199保存液：20ml犊牛血清：10ml3％碳酸氢钠：12ml0.5％中性红：6ml双蒸水：52ml，100ml(40－45℃水浴备用)说明：在其次层琼脂中，中性红的最终浓度应为1:5000－1:10000。2％琼脂：精制琼脂糖：2g100ml(0.112MPa1540－45℃水浴备用。)定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在肯定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。而一般在死亡率越接近50％时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，半数致死量(LD50)作为毒价测定单位即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在肯定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)。用细胞培育测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充10-1悬液，3000r/min2010倍递次稀释成3……，每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射，逐日观看记录各组的死亡数。表2-24 LD50的计算〔接种剂量为0.03ml〕病毒稀释度接种鼠数活鼠数死鼠数积存总计死亡比死亡率(%)10-450501515/1510010-550501010/1010010-6514155/68310-7541511/61710-85501000/10010-95501500/150LD50ReedMuench氏法计算。高于50%的死亡分数-50% 83%-50%距离比例=────────────────────=──────=0.5高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数 83%－17%LD50的对数=50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数本例高于50%病毒稀释度的对数－6，距离比例为0.5，称释系数的对数为－1。代入上式：LgLD=-6+0.5×(－1)=－6.5LD50=10-6.5，0.03ml10-6.50.03ml能使半数小鼠发生死亡。TCID50LD50，MID50时，计算公式应改为：TCID50的对数=高于50%血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数。Karber氏法计算，其公式为：IgLD50〔TCID50〕=L+d(S－0.5)L为病毒最低稀释度的对数，d为组距，即稀释系数，S为死亡比值的和。本例L=－4，d=－1，S=1+1+5/6+1/6=3IgLD50=－4+(－1)×(3－0.5)=－6.5则 LD50=10-6.5，0.03ml留意：用本法计算稀释血清中和试验中和效价时，S应为保护比值之和。EID50的测定〔以城疫病毒为例〕将颖病毒液体10倍递次稀释法释成10-1、10-2、10-3……10-9不同稀释度，分别接种9-10日龄鸡胚尿囊腔，鸡胚必需来自0.2ml6只鸡胚为一组，以石蜡封口，置37-38℃培育，每天照蛋，24h之内死亡的鸡胚弃掉，24h之后死45天，取尿囊液作血球凝集试验，消灭血凝者判阳性，记录结果，按上述方法计算EID50。TCID50的测定〔以致细胞病变病毒为例〕取颖病毒悬液，以10倍递次稀释成不同稀释度，每个稀释度分别接种经Hank’s液洗3次的组织细胞管，每管细胞接种0.2ml，每个稀释度接种4只细胞管，接种病毒后的细胞管放在细胞盘内，细胞层一侧在下，使病毒与细胞充分接触，放置37℃吸附1h，参加维持液，置37℃培育，逐日观看TCID50。中和试验(1)病毒稀释度的选择选择病毒稀释度范围，要依据毒价测定的结果而定，如病毒的10-610-2－10-810-4－10-8其原则是：最高稀释度要求动物全存活〔或无细胞病变，最低稀释度动物全死亡〔或均消灭细胞病变。(2)血清处理用于试验的全部血清在用前须作56℃30min加温灭活。但来自不同动物的血清，灭活的温度和时间也是不同的。(3)10倍递次稀释，使之成为所需要的稀释度。(4〕感作将不同稀释度病毒分别定量参加两排无菌试管内，第一排每管参加与病毒等量的免疫〔或被检〕血清作为试验组；其次排每管参加与免疫〔或被检〕血清同种的3712h。(5)接种按“病毒价测定”中所述接种方法接种试验动物〔或鸡胚、组织细胞。观看持续时间，依据病毒和接种途径而定。中和指数据计算物按ReedMuench两氏法〔Karber〕法分别计算试验组和比照LD50〔EID50、TCID50〕试验级LD50 (EID50、TCID50)中和指数=──────────────────比照组LD50 (EID50、TCID50)LD5010-2.2LD5010-5.6103.3，103.3=1995，也就是说该待检血清中和病毒的力量比正常血清大1995倍。(7)结果判定固定血清―稀释病毒法进展中和试验，当中和指数大于50，表示补检血10-5010为无中和抗体存在。固定病毒-稀释血清法〔血清中和试验〕病毒毒价的测定〔微量法〕病毒的制备将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后参加维持液，置温箱培育；逐日观看，待细胞病变〔CPE〕达75%以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以3000r/min10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒必需是对细胞有较稳定的致病力。病毒毒价测定取置-709610倍递10-1，10-2，10-11……50μl8孔，每孔参加100细胞悬液，每块板的最终一行设8孔细胞比照，制备细胞悬液的浓度以使细胞24h5%CO23748-14h逐日观看细胞病变，记录结果。ReedMuenchTCID50。56%-50%距离比例=────────56%-33%本例高于50%病毒稀释度的对数为－6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为－1。2-25TCID50计算〔50μl〕CPECPE数累计CPE(%)CPECPE10-288039039/3910010-388031031/3110010-487123123/249610-585315415/197910-684410810/185610-78446126/183310-88262182/201010-98080260/260IgTCID50=－6＋0.26×(－1)=－6.3TCID50=10-6.3，5010-6.350μl，可使半数组织细胞管发生病变。中和试验血清的处理动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有关心作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排解这些不耐热的非特异性反响因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。各种不同来源的血清，须承受不同温度处理，猪、牛、60℃；水牛、狗及地鼠血清为6265℃；人和豚鼠5620-30min，60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。稀释血清取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培育板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每孔含量为50μl4孔。病毒取－70200TCID50稀释〔与等量血D稀释。感作每孔参加50μl371h。病毒与血清混合，0℃下，不发生中反响，4℃以上中和反响即可发生。常规承受37℃作用1h，一般病毒都可发生充分的中和反响。但对易于灭活的病毒可置4℃冰箱感作，依据不同耐热性的病毒感作温度和时间应有所不同。参加细胞悬液在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中1h100μl5%CO23748h开头逐日观看记录，14h终判。由于各种病毒引起细胞病变时间不同，终判时间应依据病毒致细胞病变的快慢而定。设立比照为保证试验结果的准确性，每次试验都必需设置以下比照，特别是在初次进展该种病毒的中和试验时，尤为重要。阳性和阴性血清比照：阳性和阴性血清与待检血清进展平行试验，阳性血清比照应不消灭细胞病变，而阴性血清比照应消灭细胞病变。0.1110、100、1000TCID50450μl100μl细胞悬液。0.1TCIDTCID50100TCIDTCID50必需引起细胞病变，否则该试验不能成立。血清毒性比照相：为检查被检血清本身对细胞有无任何毒性作用，设立被检血清毒性比照是必要的。即在组织细胞中参加低倍稀释的待检血清〔相当于中和试验中被检血