第九章-发育毒性与致畸作用课件1

生殖毒理学生殖毒理学1内容概述化学物生殖能力损伤机制化学物生殖能力损伤的检测与评价内容2第一节概述一、定义：生殖毒理学（reproductivetoxicology)主要研究环境化学物对生殖系统损害作用的原因、机制和后果。对生殖功能损害表现为：对性成熟、配子生成、性行为、生育力、妊娠、分娩和哺乳等的不良影响。第一节概述一、定义：生殖毒理学（reproductive3二、环境内分泌干扰物Environmentalendocrinedisruptors,EEDs,指环境中天然存在或污染的可模拟天然激素生理、生化作用，干扰或抑制生物体内分泌、神经或免疫系统功能，产生可逆或不可逆生物学效应的化学物。二、环境内分泌干扰物Environmentalendocr4第二节、外源化学物对雄性生殖能力的损害作用与机制１、对下丘脑－垂体—睾丸轴雄性内分泌功能的影响，表现为内分泌器官的病理损害和性激素／促性激素水平改变２、对支持细胞的影响１）破坏支持细胞间和支持细胞与生殖细胞间连接，血－睾屏障受损以及生殖细胞丢失；２）破坏细胞骨架，导致生殖细胞输送障碍，丢失；３）支持细胞空泡变性４）分裂异常５）代谢和信号传导异常第二节、外源化学物对雄性生殖能力的损害作用与机制１、对下丘脑5３、对间质细胞的影响增生／肥大、死亡４、对成熟精子的影响精子胞核ＤＮＡ损伤精子运动功能、受精力降低

３、对间质细胞的影响6第三节、外源化学物对雌性生殖能力的损害作用与机制１、对下丘脑－垂体－卵巢轴雌性内分泌功能的影响，表现为内分泌器官的病理损害和性激素／促性激素水平改变；动情周期／月经周期改变，排卵异常和性行为异常。２、配子／胚胎转运异常３、卵巢毒性等。第三节、外源化学物对雌性生殖能力的损害作用与机制１、对下丘脑7第四节、外源化学物对生殖能力影响的检测与评价目的和意义：

1、评价化学物对亲代生殖系统和子代安全性

2、生殖毒性化学物的管理和中毒预防

3、优生优育提高人口素质

第四节、外源化学物对生殖能力影响的检测与评价目的和意义：8生殖毒性评价需四方面资料1、动物毒性试验2、控制下的临床研究3、环境流行病学资料4体外试验第九章-发育毒性与致畸作用课件19一动物试验

分为四个部分：

一般生殖毒性试验致畸试验围产期毒性试验繁殖实验

第九章-发育毒性与致畸作用课件110‘（一）一般生殖毒性试验

目的：评价化学毒物对生殖细胞（雌、雄）、胚胎、胎儿的影响（以下引自新药临床前研究指导原则汇编——药学、药理学、毒理学）

动物：多用大鼠，雌、雄各20只如必要可用家兔，避孕药还需用猴子试验。

剂量与给药途径：根据亚急性毒性试验结果和毒代动力学试验数据设定至少两个剂量组，高剂量组可产生轻微毒性反应，给药途径原则上与临床拟用途径同。

‘11给药时间：交配前，雄60—80天，雌14天，连续给药。雌动物交配后继续给药至多数器官形成期。大鼠器官形成期一般为：6-15d对照：阴性（溶剂）对照，也可设阳性对照观察指标与报告：动物一般状况、体重变化、受孕率、死胎数、活胎数、活胎重量、外观和内脏及骨骼变化，必要时做组织学检查，统计处理，结果综合分析第九章-发育毒性与致畸作用课件112（二）致畸试验目的：预测环境有害物质对人体的胚胎毒性及致畸性原理：母体在受孕期间受到可通过胎盘屏障的某种有害物质作用，影响胚胎的器官分化与发育，导致结构和机能的缺陷，出现胎儿畸形。在受孕动物的胚胎着床后，并已开始进入细胞及器官分化期时投以受试物，可检出该物质对胎儿的致畸作用。动物：首选性成熟大鼠（Wistar或S.D)，80—90只，雌、雄各半，鼠龄90—100d，体重雄180g,雌150g（二）致畸试验13动物也可用小鼠或家兔剂量分组：一般设四个组，一个空白对照，三个实验组，必要时设阳性对照。可采用1/4、1/16、1/64LD50或以亚急性毒性试验的最大无作用剂量为最高剂量组，其1/30左右为低剂量组，在中间设一组。

剂量设定原则：高剂量组应有母体毒性，如摄食量减少、体重增长缓慢或下降，阴道流血、流产等。药物可用最大给药量，但限制剂量为1g/Kg。低剂量应无母体毒性和胚胎反应。动物也可用小鼠或家兔14给药途径：药物拟用给药途径或灌胃、自由摄取，但不宜用腹腔注射。给药时间：于胚胎器官形成期连续给药。大鼠：孕后6-15天小鼠：孕后6-15天家兔：孕后6-18天对照：必须设溶剂对照，必要时设阳性对照。可供选择的阳性对照物有敌枯双（0.5-1.0mg/kg体重），五氯酚纳（30mg/kg/体重）阿斯匹林（250-300mg/kg）及维生素A(25000-40000IU)等.给药途径：药物拟用给药途径或灌胃、自由摄取，但不宜用腹腔注射15观察与检查：妊娠零天（判定方法）开始，记录实验动物症状、体重（0、3、7、10、16、20d）；20天处死，记录孕鼠重、黄体数、死胎数、（着床数、吸收胎、早期死胎、晚期死胎）、活胎数、活胎重、外观异常等；一半胎鼠用Bouin氏液固定做内脏检查，一半茜素红染色做骨骼畸形检查。报告：将以上数据整理成表，并计算各种畸形率，骨骼还要分析骨化程度判定：各项数据经统计处理后判定胚胎毒性和致畸潜力。观察与检查：妊娠零天（判定方法）开始，记录实验动物症状、体重16LD50致畸指数=最小致畸剂量用来评价致畸强度，10以下为不致畸，10-100为致畸，100以上为强致畸第九章-发育毒性与致畸作用课件117注意事项：1、该试验不能肯定或排除由于两性配子损伤所引起的畸形和胚胎毒性2、给药剂量、时间、途径、动物敏感性对实验结果有明显影响3、阴性（溶剂）对照也会有个别畸形或/和变异4某些畸形或变异如多肋、短尾不影响后代存活和健康；某些部位或器官的骨化迟缓，如胸骨、脊椎骨、趾骨、枕骨，可在出生后赶上正常动物，属于胚胎毒性而非畸形。5、变异与畸形的内在联系注意事项：18（三）围产期毒性实验目的：评价化学物于孕后期至断乳期之间对孕鼠/哺乳鼠和胎儿/新生仔的潜在不良影响动物：通常用小鼠、大鼠或家兔，每组孕鼠15-20只，家兔8-12只剂量与给药途径：与一般生殖毒性试验同

给药时间：大、小鼠于妊娠第15天开始给药，至分娩后21天（小鼠）和28天（大鼠），家兔于妊娠后22天开始给药，至分娩后31天。（三）围产期毒性实验19对照：阴性（溶剂）对照，也可设阳性对照观察与报告：观察动物一般状况，记录胎仔数、一般发育状况和外观畸形等。取一定数量幼仔配对饲养，继续观察其存活、生长发育，包括行为、生殖功能及其它异常症状，必要时可对F1代动物进行运动和学习能力的测定等。根据上述资料的统计分析结果结合病理组织学检查，对围产期给药的毒性及程度做出综合评价第九章-发育毒性与致畸作用课件120（四）繁殖试验（reproductionstudies）又称多代繁殖试验（multigenerationreproductionstudies）目的：评价受试物对亲代生殖和后代发育与生殖的影响，尤其那些人类长期或世代接触并可能在体内累积的化学物。优点：可同时分析化学物的生殖、母体及发育毒性。动物：大鼠，雌、雄各20只（或雄10只）剂量分组：设对照组、低剂量组（可按最大无作用剂量的1/30或可能摄入量的100倍），高剂量组（为最大耐受量或有胚胎毒性的阈剂量）（四）繁殖试验（reproductionstudies）21给药方式：加入饲料或饮水中，亲代、子代接受相同的剂量、饲料、饮水。受试物占饲料的比例不超过20%。观察指标：一般健康状况、体重、进食量、死亡情况、受孕率、妊娠率、出生存活率、哺乳存活率（4d、21d）、产仔总数、宫重及平均仔重。第九章-发育毒性与致畸作用课件122计算：

受孕率（%）=怀孕动物数/交配雌性动物数x100

妊娠率（%）=分娩活体的动物数/怀孕动物数x100

出生存活率（%）=产后4d仔鼠存活数/出生时活仔数x100

哺乳存活率（%）=21d断乳时仔鼠存活数/出生4d后仔鼠存活数x100计算：23繁殖试验流程图：见附页第九章-发育毒性与致畸作用课件124结果评价：1、交配至分娩数据反映母体毒性和胚胎/发育毒性2、出生至断乳数据反映乳母感受性和仔鼠生长发育3、断乳至性成熟数据提示早期效应的持续性和对未成年个体的直接效应4F0和F1代数据的比较反映受试物对亲代生殖细胞和激素系统影响第九章-发育毒性与致畸作用课件125二、环境流行病学研究可采用前瞻性队列研究以及回顾性或横断面研究研究内容包括：问卷调查检查及化验：生殖功能、临床检验如精液、激素、分子生物学化学毒物污染的检测生物标记物检测第九章-发育毒性与致畸作用课件126三、控制下的临床研究如新药临床终试以确定对病人的安全性对于化学毒物可选择暴露人群，特别是高危/敏感人群以及志愿者，如保健食品的人群试食。但控制下的临床研究有一定局限性，只适用于那些引起短期效应和能较快逆转的效应，不适于那些主要引起慢性疾病的效应。第九章-发育毒性与致畸作用课件127四、体外试验研究1、大鼠全胚胎培养（wholeembryoculture）取材：从孕9-10天大鼠子宫取出胚胎，去胎膜，在含受试物的培养液中O2、CO2、N2环境下培养。观察：胚胎发育情况，记录肢芽数量和长度、卵黄囊直径、体节和体长等评价：根据Brown量表平分。2、胚胎细胞微团培养（micromassculture）用来评价细胞毒性和发育毒性从孕11天的大鼠胚胎取不同部位的细胞微团在含受试物的培养瓶中培养5天。四、体外试验研究28分析：中性红染色判断细胞存活率其他染色检测细胞分化程度。3、生精细胞与间质细胞共培养4胚胎干细胞分析：中性红染色判断细胞存活率29生殖毒理学生殖毒理学30内容概述化学物生殖能力损伤机制化学物生殖能力损伤的检测与评价内容31第一节概述一、定义：生殖毒理学（reproductivetoxicology)主要研究环境化学物对生殖系统损害作用的原因、机制和后果。对生殖功能损害表现为：对性成熟、配子生成、性行为、生育力、妊娠、分娩和哺乳等的不良影响。第一节概述一、定义：生殖毒理学（reproductive32二、环境内分泌干扰物Environmentalendocrinedisruptors,EEDs,指环境中天然存在或污染的可模拟天然激素生理、生化作用，干扰或抑制生物体内分泌、神经或免疫系统功能，产生可逆或不可逆生物学效应的化学物。二、环境内分泌干扰物Environmentalendocr33第二节、外源化学物对雄性生殖能力的损害作用与机制１、对下丘脑－垂体—睾丸轴雄性内分泌功能的影响，表现为内分泌器官的病理损害和性激素／促性激素水平改变２、对支持细胞的影响１）破坏支持细胞间和支持细胞与生殖细胞间连接，血－睾屏障受损以及生殖细胞丢失；２）破坏细胞骨架，导致生殖细胞输送障碍，丢失；３）支持细胞空泡变性４）分裂异常５）代谢和信号传导异常第二节、外源化学物对雄性生殖能力的损害作用与机制１、对下丘脑34３、对间质细胞的影响增生／肥大、死亡４、对成熟精子的影响精子胞核ＤＮＡ损伤精子运动功能、受精力降低

３、对间质细胞的影响35第三节、外源化学物对雌性生殖能力的损害作用与机制１、对下丘脑－垂体－卵巢轴雌性内分泌功能的影响，表现为内分泌器官的病理损害和性激素／促性激素水平改变；动情周期／月经周期改变，排卵异常和性行为异常。２、配子／胚胎转运异常３、卵巢毒性等。第三节、外源化学物对雌性生殖能力的损害作用与机制１、对下丘脑36第四节、外源化学物对生殖能力影响的检测与评价目的和意义：

1、评价化学物对亲代生殖系统和子代安全性

2、生殖毒性化学物的管理和中毒预防

3、优生优育提高人口素质

第四节、外源化学物对生殖能力影响的检测与评价目的和意义：37生殖毒性评价需四方面资料1、动物毒性试验2、控制下的临床研究3、环境流行病学资料4体外试验第九章-发育毒性与致畸作用课件138一动物试验

分为四个部分：

一般生殖毒性试验致畸试验围产期毒性试验繁殖实验

第九章-发育毒性与致畸作用课件139‘（一）一般生殖毒性试验

目的：评价化学毒物对生殖细胞（雌、雄）、胚胎、胎儿的影响（以下引自新药临床前研究指导原则汇编——药学、药理学、毒理学）

动物：多用大鼠，雌、雄各20只如必要可用家兔，避孕药还需用猴子试验。

剂量与给药途径：根据亚急性毒性试验结果和毒代动力学试验数据设定至少两个剂量组，高剂量组可产生轻微毒性反应，给药途径原则上与临床拟用途径同。

‘40给药时间：交配前，雄60—80天，雌14天，连续给药。雌动物交配后继续给药至多数器官形成期。大鼠器官形成期一般为：6-15d对照：阴性（溶剂）对照，也可设阳性对照观察指标与报告：动物一般状况、体重变化、受孕率、死胎数、活胎数、活胎重量、外观和内脏及骨骼变化，必要时做组织学检查，统计处理，结果综合分析第九章-发育毒性与致畸作用课件141（二）致畸试验目的：预测环境有害物质对人体的胚胎毒性及致畸性原理：母体在受孕期间受到可通过胎盘屏障的某种有害物质作用，影响胚胎的器官分化与发育，导致结构和机能的缺陷，出现胎儿畸形。在受孕动物的胚胎着床后，并已开始进入细胞及器官分化期时投以受试物，可检出该物质对胎儿的致畸作用。动物：首选性成熟大鼠（Wistar或S.D)，80—90只，雌、雄各半，鼠龄90—100d，体重雄180g,雌150g（二）致畸试验42动物也可用小鼠或家兔剂量分组：一般设四个组，一个空白对照，三个实验组，必要时设阳性对照。可采用1/4、1/16、1/64LD50或以亚急性毒性试验的最大无作用剂量为最高剂量组，其1/30左右为低剂量组，在中间设一组。

剂量设定原则：高剂量组应有母体毒性，如摄食量减少、体重增长缓慢或下降，阴道流血、流产等。药物可用最大给药量，但限制剂量为1g/Kg。低剂量应无母体毒性和胚胎反应。动物也可用小鼠或家兔43给药途径：药物拟用给药途径或灌胃、自由摄取，但不宜用腹腔注射。给药时间：于胚胎器官形成期连续给药。大鼠：孕后6-15天小鼠：孕后6-15天家兔：孕后6-18天对照：必须设溶剂对照，必要时设阳性对照。可供选择的阳性对照物有敌枯双（0.5-1.0mg/kg体重），五氯酚纳（30mg/kg/体重）阿斯匹林（250-300mg/kg）及维生素A(25000-40000IU)等.给药途径：药物拟用给药途径或灌胃、自由摄取，但不宜用腹腔注射44观察与检查：妊娠零天（判定方法）开始，记录实验动物症状、体重（0、3、7、10、16、20d）；20天处死，记录孕鼠重、黄体数、死胎数、（着床数、吸收胎、早期死胎、晚期死胎）、活胎数、活胎重、外观异常等；一半胎鼠用Bouin氏液固定做内脏检查，一半茜素红染色做骨骼畸形检查。报告：将以上数据整理成表，并计算各种畸形率，骨骼还要分析骨化程度判定：各项数据经统计处理后判定胚胎毒性和致畸潜力。观察与检查：妊娠零天（判定方法）开始，记录实验动物症状、体重45LD50致畸指数=最小致畸剂量用来评价致畸强度，10以下为不致畸，10-100为致畸，100以上为强致畸第九章-发育毒性与致畸作用课件146注意事项：1、该试验不能肯定或排除由于两性配子损伤所引起的畸形和胚胎毒性2、给药剂量、时间、途径、动物敏感性对实验结果有明显影响3、阴性（溶剂）对照也会有个别畸形或/和变异4某些畸形或变异如多肋、短尾不影响后代存活和健康；某些部位或器官的骨化迟缓，如胸骨、脊椎骨、趾骨、枕骨，可在出生后赶上正常动物，属于胚胎毒性而非畸形。5、变异与畸形的内在联系注意事项：47（三）围产期毒性实验目的：评价化学物于孕后期至断乳期之间对孕鼠/哺乳鼠和胎儿/新生仔的潜在不良影响动物：通常用小鼠、大鼠或家兔，每组孕鼠15-20只，家兔8-12只剂量与给药途径：与一般生殖毒性试验同

给药时间：大、小鼠于妊娠第15天开始给药，至分娩后21天（小鼠）和28天（大鼠），家兔于妊娠后22天开始给药，至分娩后31天。（三）围产期毒性实验48对照：阴性（溶剂）对照，也可设阳性对照观察与报告：观察动物一般状况，记录胎仔数、一般发育状况和外观畸形等。取一定数量幼仔配对饲养，继续观察其存活、生长发育，包括行为、生殖功能及其它异常症状，必要时可对F1代动物进行运动和学习能力的测定等。根据上述资料的统计分析结果结合病理组织学检查，对围产期给药的毒性及程度做出综合评价第九章-发育毒性与致畸作用课件149（四）繁殖试验（reproductionstudies）又称多代繁殖试验（multigenerationreproductionstudies）目的：评价受试物对亲代生殖和后代发育与生殖的影响，尤其那些人类长期或世代接触并可能在体内累积的化学物。优点：可同时分析化学物的生殖、母体及发育毒性。动物：大鼠，雌、雄各20只（或雄10只）剂量分组：设对照组、低剂量组（可按最大无作用剂量的1/30或可能摄入量的100倍），高剂量组（为最大耐受量或有胚胎毒性的阈剂量）（四）繁殖试验（reproductionstudies）50给药方式：加入饲料或饮水中，亲代、子代接受相同的剂量、饲料、饮水。受试物占饲料的比例不超过20%。观察指标：一般健康状况、体重、进食量、死亡情况、受孕率、妊娠率、出生存活率、哺乳存活率（4d、21d）、产仔总数、宫重及平均仔重。第九章-发育毒性与致畸作用课件151计算：

受孕率（%）=怀孕动物数/交配雌性动物数x100

妊娠率（%）=分