抗真菌药敏试验及结果判读课件

抗真菌药敏试验及结果判读主讲人：刘伟北京大学第一医院皮肤性病科真菌室

国家皮肤与免疫疾病临床研究中心

北京大学真菌和真菌病研究中心抗真菌药敏试验及结果判读主讲人：刘伟北京大学第一医院皮肤性病1

北京大学第一医院

教授、博士生导师

皮肤病分子诊断北京市重点实验

室副主任

教育部新世纪优秀人才

XXX主任医师/副主任医师/主治医师

刘伟主任医师北京大学第一医院 XXX 刘伟201020403目录

05抗真菌药敏试验及意义纸片扩散法

E-test法液基稀释法

临床意义010203目抗真菌药敏试验及意义纸片扩散法3抗真菌药敏试验及意义01抗真菌药敏试验及意义014抗真菌药敏试验及意义

定义

是测定抗真菌药物对病原真菌的最低抑菌浓度（MIC）--可抑制病原真菌生长

的最低药物浓度，和最低杀菌浓度（MFC）--可杀死真菌的最低药物浓度，及

最低有效浓度（MEC）--出现有效抑制作用的最低药物浓度，的体外试验方法

意义监测临床病原真菌对不同抗真菌药物的体外敏感性，对于已有药物指导临床用药的选择，发现新型耐药株评价新型抗真菌药物的体外抗菌活性，开发新药

种类纸片扩散法、E-test法、液剂稀释法抗真菌药敏试验及意义定义是测定抗真菌药物对病原真菌5抗真菌药物——分类及作用机制•••••作用靶点为麦角固醇

(细胞膜)多烯类--Drug-ergosterol

interaction

Amphotericin

B,

nystatin唑类--Inhibition

of

ergosterolsynthesis

Imidazoles:

Triazoles:丙烯胺类--

Inhibition

of

ergosterolsynthesis

Terbinafine,

butenafine吗啉类--Inhibition

of

ergosterolsynthesis•••••作用靶点为细胞壁棘白菌素类--抑制匍聚糖合成Echinocandins肽-核苷类—抑制几丁质合成

Nikkomycin

Z嘧啶类—干扰核酸合成

Flucytosine其它类

Sordarins,

azasordarins

Griseofulvin

AmorolfineCanuto

et

al.

The

Lancet

Infect

Dis

2002;

2:

550抗真菌药物——分类及作用机制•作用靶点为麦角固醇(细胞膜)6纸片扩散法02纸片扩散法027纸片扩散法

临床实验室标准研究所（Clinical

laboratory

standard

institute，CLSI）M44-A

Tested

Drug：FLC，VRC

Media：Mueller-Hinton

agar

+

2%dextrose

+

0.5ug/ml

methylene

blue

Quality

control：C.albicans

ATCC

90028，C.parapsilosis

ATCC

22019，C.tropicalis

ATCC

750，C.krusei

ATCC

6258

质控以ATCC

22019为例FLC：25ug，22-23mmVRC:

1ug，28-37mm纸片扩散法临床实验室标准研究所（Clinicallab8

纸片扩散法

临床实验室标准研究所（Clinical

laboratory

standard

institute，CLSI）

M44-A

操作

用无菌生理盐水制备菌悬液，调整菌悬液浓度（1-5×106CFU/mL）后用棉签沾

取菌液，均匀沿3个方向涂布；室温下放置15分钟待干燥后将药片紧密压在培养

基上，于35℃下孵育18-24小时，测量抑菌圈直径，据以确定药敏

结果（mm）和判读折点SusS-DDResVRC>=1714-16=<13FLC

>=19

15-18=<14 纸片扩散法SusS-DDResVRC>=1714-169E-test法03E-test法0310E-test法

是将不同量的抗真菌药物包被在商品化的特殊试剂条上进行测定的方法

Tested

Drug：FLC，ITC，VRC，CAS，

AMB等

Media：PMI

1640

+

MOPS+2%

glucose

+1.5%Bacto琼脂

Quality

controlE-test法是将不同量的抗真菌药物包被在商品化的特殊试11E-test法

操作用无菌生理盐水覆盖生长良好的菌落后，吸取菌悬液，调整菌悬液浓度，用无菌棉签沾取菌悬液，均匀沿3个方向涂布于平板上，将琼脂板在生物安全柜中室温放置15分钟，待其表面干燥；用无菌镊子将真菌药敏条置于平皿上，不再移动；然后置于35℃下孵育，其中念珠菌孵育24-48小时、新生隐球菌48-72小时、曲霉及根霉18-24小时、镰刀菌24-48小时后移至室温24-48小时；每天检查抑菌圈，读取结果E-test法操作用无菌生理盐水覆盖生长良好的菌落后，吸12液基稀释法04液基稀释法0413液基稀释法

临床实验室标准研究所（Clinical

laboratory

standard

institute，CLSI）方案

国内于1994年及时引进并推广应用，对于酵母菌的M27-P，T，A，A2方案，分为试管法和微量法，以后者为主

对于丝状菌，

2002年问世，试管法和微量法，后者为主

Medium，inoculation，incubation，终点判读均统一规定

质量控制：

C.

albicans

ATCC

90028、C.

parapsilosis

ATCC

22019、C.

tropicalisATCC

750、C.

krusei

ATCC

6258等意义：保证操作方法尽可能标准化液基稀释法临床实验室标准研究所（Clinicallab14液基稀释法—操作

药液制备

培养基：RPMI

1640

液基（含MOPS，pH7.0）

水溶性药物：如FLC，蒸馏水制备储存液

先称量，制备20倍于最高药敏试验浓度的药液（如1280）；然后以RPMI1640稀释，分别获得10倍于各个浓度的药液（640），进一步以RPMI1640分别稀释5倍后，接种于药敏板

非水溶性药物：如ITC等，DMSO制备储存液，浓度不超过1%

先称量，制备100倍于最高药敏试验浓度的药液（如1600）；然后以DMSO稀释，分别获得100倍于各个浓度的药液（800，400），进一步以RPMI1640分别稀释50倍后，接种于药敏板液基稀释法—操作药液制备培养基：RPMI164015液基稀释法—操作

菌悬液制备

酵母菌：

35度，PDA或SDA孵育24-48h丝状菌：曲霉，波氏，孢子丝菌等，35度，PDA孵育7天；镰刀菌，

35度，PDA孵育48-72h,继续在25度孵育7天----以保证菌的纯度和活力

以生理盐水制备悬液，到0.5McFarland或计数到1-5X106CFU/ml;

进一步稀释100

倍（丝状菌，

0.5-2.5X104CFU/ml

）或1000倍（酵母菌，0.5-2.5X103CFU/ml）液基稀释法—操作菌悬液制备酵母菌：35度，PDA16液基稀释法—结果

MIC:

与生长对照管比较，生长受抑管的最低药物浓度即为MIC值

不同的药物有不同的判读标准-AmB:

典型，容易判断，100%受抑为标准-Azoles

and

5-FC:

终点常不清楚，以50%（M27-A2），或100%（M38-A中ITC）受抑为标准

MFC：Minimal

fungalcidal

concentration

MEC：minimal

effective

concentration

对照：

生长对照：

不生长对照：液基稀释法—结果MIC:与生长对照管比较，生长受抑管的17MIC（μg/ml）敏感S剂量依赖性敏感SDD中介I耐药RFLC<=24->=8ITC*<=0.120.25-0.5->=1VRC<=0.12-0.25-0.5>=1CAS<=0.25-0.5>=1MCFG<=0.25-0.5>=1ANDFG<=0.25-0.5>=1液基稀释法—结果判读折点

白念珠菌,

热带念珠菌及近平滑念珠菌(24h)近平滑念珠菌的棘白菌素类药物判读折点:

<=2

S，4

Intermediate，>=8

resistantMIC（μg/ml）敏感剂量依赖性敏感中介耐药FLC<=2418液基稀释法—念珠菌临床判读折点（24h）AntifungalagentsSpeciesMIC

Range

(μg/mL)SSDD/IRFLCVRCCASMCFGANFGC.

albicans/C.

parapsilosis/C.

tropicalisC.

glabrataC.

albicans/C.

parapsilosis/C.

tropicalisC.

kruseiC.

albicans/C.

tropicalis/C.

kruseiC.

glabrataC.

parapsilosi/C.

guilliermondiiC.

albicans/C.

tropicalis/C.

kruseiC.

glabrataC.

parapsilosi/C.

guilliermondiiC.

albicans/C.

tropicalis/C.

kruseiC.

glabrataC.

parapsilosi/C.

guilliermondii≤2≤0.12≤0.5≤0.25≤0.12≤2≤0.25≤0.06≤2≤0.25≤0.12≤24≤320.25-0.510.50.2540.50.1240.50.254≥8≥64≥1≥2≥1≥0.5≥8≥1≥0.25≥8≥1≥0.5≥8液基稀释法—念珠菌临床判读折点（24h）Antifungal19液基稀释法—CLSI流行病学折点（曲霉，48h）AntifungalagentsItraconazoleVoriconazlePosaconazoleAmphotericin

BCaspofunginSpeciesA.

fumigatus/A.

flavus/

A.

terreus/

A.

nidulansA.

niger/A.

versicolorA.

fumigatus/A.

flavus/

A.

terreusA.

niger/A.

nidulans/A.

versicolorA.

fumigatus/A.

terreus/

A.

nigerA.

flavusA.

nidulans/A.

versicolorA.

fumigatus/A.

flavus/

A.

niger/

A.

versicolorA.

nidulans/A.

terreusA.

fumigatus/A.

nidulansA.

flavus/

A.

niger/A.

terreus/A.

versicolorECV(μg/mL)12120.50.251240.50.25液基稀释法—CLSI流行病学折点（曲霉，48h）Antifu20试验方法检测菌种肉汤稀释法(Microbroth/Microtiter)M27-A3酵母菌M38-A2霉菌纸片扩散法(DiskDiffusion)M44-A酵母菌M51-P霉菌试验方法检测菌种肉汤稀释法(Microbroth/Microtiter)E.DEF7.2酵母菌E.DEF9.1霉菌

EUCAST法

临床实验室标准研究所（European

Commission

on

Antimicrobial

Susceptibility

Testing，EUCAST）方案EUCAST对CLSI法进行修订，形成了自己的标准方法EUCAST

的区别：接种浓度是CLSI的100倍；RPMI悬液包含葡萄糖浓度为2%，是CLSI的10倍；培育时间是24小时，而CLSI是48小时在一项比较性研究中，从血流分离100株念珠菌,

两种方法显示出良好的一致性试验方法检测菌种肉汤稀释法M27-A3酵母菌M38-A2霉菌21药物MIC(g/mL)SIR伊曲康唑＜22＞2伏立康唑＜22＞2泊沙康唑＜0.250.25＞0.25液基稀释法—EUCAST法折点（曲霉，24h）烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和构巢曲霉多唑类药物耐药泛唑类药物耐药特定唑类药物耐药药物MIC(g/mL)SIR伊曲康唑＜22＞2伏立康唑＜222对临床的意义05对临床的意义0523Correlation

of

antifungal

susceptibilitywith

clinical

outcome

（一致性）•

CLSI

M27-AFLC对600余株念珠菌MIC值：分离自150余例AIDS的食管念珠菌病，一致性好；治疗失败者，MIC值大于64

µg/mlMahmoud

A.G,

JCM

1996,

34:489-495Correlationofantifungalsusc24Keep

in

mind•

90-60

rule—MIC

vs

clinical

outcome

临床疗效

susceptible：90%

response

to

therapy对治疗有效

resistant：60%

response

to

therapy对治疗有效Rex

J,CID

2002,

35:

982Keepinmind•90-60rule—MIC25Application

of

antifungal

susceptibility•suggestions

疾病孤立的粘膜念珠菌病复发的粘膜念珠菌病高危患者中念珠菌定植

应该经验性治疗念珠菌血症及深部感染深部感染需要延长治疗时

建议

经验性治疗，不做药敏

菌种鉴定，如果治疗失

败应该考虑到药敏菌种鉴定，建立当地药

敏试验流行病学资料菌种鉴定，应用唑类药

物时应该考虑药敏试验，

并定期掌握当地药敏试验

流行病学资料

对所有菌株都测药敏Hopenthal

et

al,

Diagn

Microb

Infect

Dis,

2004,

48:153-160Applicationofantifungalsusc26•女性，10岁，急淋，在化疗过程中出现高热；给予头孢匹胺等抗细菌、氟康唑预防真菌感染处理；肺部CT检示：肺内结节灶；痰镜检示：分支分隔菌丝，培养为烟曲霉，改用VRC；9天后，体温38.1℃，咳嗽减轻；继续治疗一周后复查CT见肺脏病变减轻不明显，故而给予AMB，20mg/d，一周后无发热、咳嗽，肺内病变未扩大；继续治疗一周后无明显症状，CT示肺内结节局限，故停用AMB而出院Sample

IDICZVCZPCZCYP51AMAT微卫星CSP4787-1>1681TR34/L98H114-21-8-31-8-6-8-10-20t024787-2>1621297T/F495ITR34/L98H/S

223-23-8-29-8-6-8-10-20t02

耐三唑类的烟曲霉混合感染检测到耐药菌株应该更换抗真菌药物治疗•女性，10岁，急淋，在化疗过程中出现高热；给予头孢匹胺等抗27感谢聆听感谢聆听28抗真菌药敏试验及结果判读主讲人：刘伟北京大学第一医院皮肤性病科真菌室

国家皮肤与免疫疾病临床研究中心

北京大学真菌和真菌病研究中心抗真菌药敏试验及结果判读主讲人：刘伟北京大学第一医院皮肤性病29

北京大学第一医院

教授、博士生导师

皮肤病分子诊断北京市重点实验

室副主任

教育部新世纪优秀人才

XXX主任医师/副主任医师/主治医师

刘伟主任医师北京大学第一医院 XXX 刘伟3001020403目录

05抗真菌药敏试验及意义纸片扩散法

E-test法液基稀释法

临床意义010203目抗真菌药敏试验及意义纸片扩散法31抗真菌药敏试验及意义01抗真菌药敏试验及意义0132抗真菌药敏试验及意义

定义

是测定抗真菌药物对病原真菌的最低抑菌浓度（MIC）--可抑制病原真菌生长

的最低药物浓度，和最低杀菌浓度（MFC）--可杀死真菌的最低药物浓度，及

最低有效浓度（MEC）--出现有效抑制作用的最低药物浓度，的体外试验方法

意义监测临床病原真菌对不同抗真菌药物的体外敏感性，对于已有药物指导临床用药的选择，发现新型耐药株评价新型抗真菌药物的体外抗菌活性，开发新药

种类纸片扩散法、E-test法、液剂稀释法抗真菌药敏试验及意义定义是测定抗真菌药物对病原真菌33抗真菌药物——分类及作用机制•••••作用靶点为麦角固醇

(细胞膜)多烯类--Drug-ergosterol

interaction

Amphotericin

B,

nystatin唑类--Inhibition

of

ergosterolsynthesis

Imidazoles:

Triazoles:丙烯胺类--

Inhibition

of

ergosterolsynthesis

Terbinafine,

butenafine吗啉类--Inhibition

of

ergosterolsynthesis•••••作用靶点为细胞壁棘白菌素类--抑制匍聚糖合成Echinocandins肽-核苷类—抑制几丁质合成

Nikkomycin

Z嘧啶类—干扰核酸合成

Flucytosine其它类

Sordarins,

azasordarins

Griseofulvin

AmorolfineCanuto

et

al.

The

Lancet

Infect

Dis

2002;

2:

550抗真菌药物——分类及作用机制•作用靶点为麦角固醇(细胞膜)34纸片扩散法02纸片扩散法0235纸片扩散法

临床实验室标准研究所（Clinical

laboratory

standard

institute，CLSI）M44-A

Tested

Drug：FLC，VRC

Media：Mueller-Hinton

agar

+

2%dextrose

+

0.5ug/ml

methylene

blue

Quality

control：C.albicans

ATCC

90028，C.parapsilosis

ATCC

22019，C.tropicalis

ATCC

750，C.krusei

ATCC

6258

质控以ATCC

22019为例FLC：25ug，22-23mmVRC:

1ug，28-37mm纸片扩散法临床实验室标准研究所（Clinicallab36

纸片扩散法

临床实验室标准研究所（Clinical

laboratory

standard

institute，CLSI）

M44-A

操作

用无菌生理盐水制备菌悬液，调整菌悬液浓度（1-5×106CFU/mL）后用棉签沾

取菌液，均匀沿3个方向涂布；室温下放置15分钟待干燥后将药片紧密压在培养

基上，于35℃下孵育18-24小时，测量抑菌圈直径，据以确定药敏

结果（mm）和判读折点SusS-DDResVRC>=1714-16=<13FLC

>=19

15-18=<14 纸片扩散法SusS-DDResVRC>=1714-1637E-test法03E-test法0338E-test法

是将不同量的抗真菌药物包被在商品化的特殊试剂条上进行测定的方法

Tested

Drug：FLC，ITC，VRC，CAS，

AMB等

Media：PMI

1640

+

MOPS+2%

glucose

+1.5%Bacto琼脂

Quality

controlE-test法是将不同量的抗真菌药物包被在商品化的特殊试39E-test法

操作用无菌生理盐水覆盖生长良好的菌落后，吸取菌悬液，调整菌悬液浓度，用无菌棉签沾取菌悬液，均匀沿3个方向涂布于平板上，将琼脂板在生物安全柜中室温放置15分钟，待其表面干燥；用无菌镊子将真菌药敏条置于平皿上，不再移动；然后置于35℃下孵育，其中念珠菌孵育24-48小时、新生隐球菌48-72小时、曲霉及根霉18-24小时、镰刀菌24-48小时后移至室温24-48小时；每天检查抑菌圈，读取结果E-test法操作用无菌生理盐水覆盖生长良好的菌落后，吸40液基稀释法04液基稀释法0441液基稀释法

临床实验室标准研究所（Clinical

laboratory

standard

institute，CLSI）方案

国内于1994年及时引进并推广应用，对于酵母菌的M27-P，T，A，A2方案，分为试管法和微量法，以后者为主

对于丝状菌，

2002年问世，试管法和微量法，后者为主

Medium，inoculation，incubation，终点判读均统一规定

质量控制：

C.

albicans

ATCC

90028、C.

parapsilosis

ATCC

22019、C.

tropicalisATCC

750、C.

krusei

ATCC

6258等意义：保证操作方法尽可能标准化液基稀释法临床实验室标准研究所（Clinicallab42液基稀释法—操作

药液制备

培养基：RPMI

1640

液基（含MOPS，pH7.0）

水溶性药物：如FLC，蒸馏水制备储存液

先称量，制备20倍于最高药敏试验浓度的药液（如1280）；然后以RPMI1640稀释，分别获得10倍于各个浓度的药液（640），进一步以RPMI1640分别稀释5倍后，接种于药敏板

非水溶性药物：如ITC等，DMSO制备储存液，浓度不超过1%

先称量，制备100倍于最高药敏试验浓度的药液（如1600）；然后以DMSO稀释，分别获得100倍于各个浓度的药液（800，400），进一步以RPMI1640分别稀释50倍后，接种于药敏板液基稀释法—操作药液制备培养基：RPMI164043液基稀释法—操作

菌悬液制备

酵母菌：

35度，PDA或SDA孵育24-48h丝状菌：曲霉，波氏，孢子丝菌等，35度，PDA孵育7天；镰刀菌，

35度，PDA孵育48-72h,继续在25度孵育7天----以保证菌的纯度和活力

以生理盐水制备悬液，到0.5McFarland或计数到1-5X106CFU/ml;

进一步稀释100

倍（丝状菌，

0.5-2.5X104CFU/ml

）或1000倍（酵母菌，0.5-2.5X103CFU/ml）液基稀释法—操作菌悬液制备酵母菌：35度，PDA44液基稀释法—结果

MIC:

与生长对照管比较，生长受抑管的最低药物浓度即为MIC值

不同的药物有不同的判读标准-AmB:

典型，容易判断，100%受抑为标准-Azoles

and

5-FC:

终点常不清楚，以50%（M27-A2），或100%（M38-A中ITC）受抑为标准

MFC：Minimal

fungalcidal

concentration

MEC：minimal

effective

concentration

对照：

生长对照：

不生长对照：液基稀释法—结果MIC:与生长对照管比较，生长受抑管的45MIC（μg/ml）敏感S剂量依赖性敏感SDD中介I耐药RFLC<=24->=8ITC*<=0.120.25-0.5->=1VRC<=0.12-0.25-0.5>=1CAS<=0.25-0.5>=1MCFG<=0.25-0.5>=1ANDFG<=0.25-0.5>=1液基稀释法—结果判读折点

白念珠菌,

热带念珠菌及近平滑念珠菌(24h)近平滑念珠菌的棘白菌素类药物判读折点:

<=2

S，4

Intermediate，>=8

resistantMIC（μg/ml）敏感剂量依赖性敏感中介耐药FLC<=2446液基稀释法—念珠菌临床判读折点（24h）AntifungalagentsSpeciesMIC

Range

(μg/mL)SSDD/IRFLCVRCCASMCFGANFGC.

albicans/C.

parapsilosis/C.

tropicalisC.

glabrataC.

albicans/C.

parapsilosis/C.

tropicalisC.

kruseiC.

albicans/C.

tropicalis/C.

kruseiC.

glabrataC.

parapsilosi/C.

guilliermondiiC.

albicans/C.

tropicalis/C.

kruseiC.

glabrataC.

parapsilosi/C.

guilliermondiiC.

albicans/C.

tropicalis/C.

kruseiC.

glabrataC.

parapsilosi/C.

guilliermondii≤2≤0.12≤0.5≤0.25≤0.12≤2≤0.25≤0.06≤2≤0.25≤0.12≤24≤320.25-0.510.50.2540.50.1240.50.254≥8≥64≥1≥2≥1≥0.5≥8≥1≥0.25≥8≥1≥0.5≥8液基稀释法—念珠菌临床判读折点（24h）Antifungal47液基稀释法—CLSI流行病学折点（曲霉，48h）AntifungalagentsItraconazoleVoriconazlePosaconazoleAmphotericin

BCaspofunginSpeciesA.

fumigatus/A.

flavus/

A.

terreus/

A.

nidulansA.

niger/A.

versicolorA.

fumigatus/A.

flavus/

A.

terreusA.

niger/A.

nidulans/A.

versicolorA.

fumigatus/A.

terreus/

A.

nigerA.

flavusA.

nidulans/A.

versicolorA.

fumigatus/A.

flavus/

A.

niger/

A.

versicolorA.

nidulans/A.

terreusA.

fumigatus/A.

nidulansA.

flavus/

A.

niger/A.

terreus/A.

versicolorECV(μg/mL)12120.50.251240.50.25液基稀释法—CLSI流行病学折点（曲霉，48h）Antifu48试验方法检测菌种肉汤稀释法(Microbroth/Microtiter)M27-A3酵母菌M38-A2霉菌纸片扩散法(DiskDiffusion)M44-A酵母菌M51-P霉菌试验方法检测菌种肉汤稀释法(Microbroth/Microtiter)E.DEF7.2酵母菌E.DEF9.1霉菌

EUCAST法

临床实验室标准研究所（European

Commission

on

Antimicrobial

Susceptibility

Testing，EUCAST）方案EUCAST对CLSI法进行修订，形成了自己的标准方法EUCAST

的区别：接种浓度是CLSI的100倍；RPMI悬液包含葡萄糖浓度为2%，是CLSI的10倍；培育时间是24小时，而CLSI是48小时在一项比较性研究中，从血流分离100株念珠菌,

两种方法显示出良好的一致性试验方法检测菌种肉汤稀释法M27-A3酵母菌M38-A2霉菌49药物MIC(g/mL)SIR伊曲