国自然面上项目标书范例

国家自然科基金申请2010版申请代码H1606受理部门收件日期受理编号解除保护国家自然科学金申请书(2010版)促请人：：266021

2月国家自然科学基金委员会第页

版本1.003.356基本信息yoKWT/OQ

国家自然科基金申请2010版申

姓

名

性别

出生年月

1973年4月

民族汉族请人

学电传

位博话真

职称主任医师每作时（月）8电子邮箱国别或地区中信

个址息

工

作

单

位主域肿瘤分子生物依信托息单位合

名联电

系

称人话

电子邮箱网站地址单位称作信研息究单位项

复大学[此录入改项目名称

Pyk2促进肝细胞迁移一个新的子制研究结合并酸cadherin?目息基本

资助类别附注说明申请代码基地类别

面上项目肿发转移

亚类说消统瘤信

研究年限

2011年1月—2013月

研究属性

基础研究申请经费

35.0000万摘要

(限400字)：E-cadherin失与肝癌转移密切相关。其丧失的主要原因是由于其酪氨酸残基被磷酸化后蛋白被降解。我通过酵母双杂交发现一个新的能E-cadherin互作用的非受体型酪氨酸激酶。Pyk2性增强可促进肝癌细胞迁移。本课题假设结并磷酸化E-cadherin，E-cadherin蛋白降解，细胞迁移性增加本课题设计首先通过pulldown免疫共沉淀证二者相互作用可靠；其次通过磷酸化实验确证Pyk2以磷酸化E-cadherin后应用细胞迁实验和裸鼠成瘤实验确定：Pyk2过磷酸化E-cadherin而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移；最后分在人肝癌标本中二者表达的相关性以及与转移的关系课新发Pyk2可接磷酸化E-cadherin进癌胞移肿瘤转移，具有国际先进性。这于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解，对于药物研发提供新的思路。第页

版本1.003.356关键(分号分开，最多5个)

国家自然科基金申请2010版肝癌；E-cadherin；Pyk2；转移第页

版本1.003.356经费申请

科目

国家自然科基金申请2010版（金额单位：万元）申请经费备注（计算依据与说明）一研经1.研业务费测试计算分析费能源动力费

28.75007.60002.1000DNA序，生物信息分析，统计分析会议差旅费出版文献信播费（5其他2.验材料费（1原材试剂药置费（2其他3.器设备费购置试制实验室改装费协作费二国合与流1.目组成员出国合作交流2.外专家来华合作交流三劳费

1.00003.00001.500021.150017.15004.00000.00001.50001.50003.0000

参加学术会议3-4人次文献检索，发表论文，专利申请成果鉴定各种试剂盒，脂质体，抗体，细胞培养，实验耗材动物饲养，临床调研邀请美国康奈尔大学关军林教授合作交流研究生加班补贴四管费

1.75005%管理费合

计

35.0000国家其他计划资助经费与本项目相关的其他经费来源

其他经费资助（含部门匹配）其经来合

0.0000第页

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国家自然科基金申请2010版报正一立依与究容：（）目立依原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国的肝癌发病数占全球所有肝癌病例的一半左右，因此我国对于肝癌的研究显得非常迫[1]

。肝癌非常容易转移，其复发转移是治疗失败的主要原因。了解肝癌侵袭转移的相关机制，对于设计合理的治疗药物，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义[2]

。E-cadherin肝癌细胞的侵袭转移中起到了不可忽视的作用E-cadherin属于钙粘附蛋白家族(Cadherin家族)，在调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的粘附反应胞间的接触抑制和凋亡等方面发挥重要作用与β等形成复合体发挥上述功能[。E-cadherin多种肿瘤的浸润转移密切相[]

。有人认为提高E-cadherin的达可以成为肿瘤治疗的一个方向[6]

。与其他肿瘤类似，研究表E-cadherin在细胞癌的阳性率显著低于癌旁组织及正常肝组织，表达越低则肿瘤病理分级越差，也越容易出现转移[7-9]有人报道缺乏E-cadherin达的人肝癌细胞株非常容易发生转移，但是转染E-cadherin后种特性发生逆转，说明-cadherin在癌细胞转移过程中发挥着重要的作用[

。E-cadherin失或低表达的机制至今仍然不是完全清楚。目前认为可能是由于基因突变导致功能丧失、启动子甲基化后转录沉默[11]

以及E-cadherin蛋被磷酸化后水解等。但是在亚洲人群中基因突变和启动子甲基化都不常见[12-13]

。因此最大的可能性是E-cadherin蛋被磷酸化后水解。有文献证明，酪氨酸残基磷酸化的E-cadherin够与Hakai（一种E3泛素连接酶）结合，使其泛素化而降[14]。那么有多少酪氨酸激酶参与这个机制呢？有报道EGFR够磷酸E-cadherin对于E-cadherin磷化的调节机制目前仍然不是非常明确。为了解E-cadherin在癌细胞的分子信号通路，我们E-cadherin胞内段）为诱饵应用酵母双杂交（CytoTRAP系统）在肝脏的DNA文库中筛选到一个新的能与E-cadherin相作用的非受体型酪氨酸激酶Pyk2。么，Pyk2是能磷酸化E-cadherin并节细胞迁移呢？Pyk2(prolinerichtyrosinekinase2)是一种富含脯氨酸的非受体型酪氨酸蛋白激酶，与FAK源度较高，属于AK族。Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀，在调节细胞存活殖和迁移[

方面受到越来越多的关注Pyk2信号通路的活化能够增强细胞运动和迁移，研究发现Pyk2在多种肿瘤的侵袭和转移中起作用[

。其中Sun等研究表明，Pyk2在9%肝癌组织中表达上调，Pyk2高表达与肝癌组织体积Edmonson第页国家自然科基金申请2010版分级呈正相关，Pyk2表越高病人预后越差。动物实验显示在侵袭边缘的肝癌细胞和转移到肺结节中的肝癌细胞均发现Pyk2高表达。肝癌细胞株转染Pyk2后，迁移功能增强裸鼠做实验发现抑制Pyk2的活性后肝癌肿瘤的大小和肺转移率都较对照明显减少[Pyk2调肿瘤转移的具体机制是什么呢？有研究表明，在肝癌细胞中，提c-Src的磷酸化水平和活性，与c-Src形成复合体激活ERK通路，从而增强肝癌细胞的侵袭性[

有报道Pyk2与血小板/内皮细胞粘附分子E-cadherin一样都属于钙粘附蛋白家族）结合并且都影响肿瘤细胞的侵袭性[；还有报道RhoC通过激活Pyk2促前列腺癌转移[18]及与SOCS3、Cyr61关等[22-23]目前Pyk2调肿瘤细胞转移的具体机制仍不十分清楚。

。总而言之，Pyk2与-cadherin能结合并调节肝癌细胞的侵袭转移呢？这是我们想要研究的问题。我们继续应用酵母双杂交反复验证、GST-Pulldown实验、免疫共沉淀证明二者相互作用是可靠的（具体结果见研究基础，现在的问题是二者在体内状态下是否结合？结合后的调节机制是什么？二者的结合位点在什么地方？结合后如何调节细胞迁移以及影响肿瘤转移？考虑到Pyk2是个激酶蛋白的前期工作发现-cadherinPyk2的酶部分结合，因此有两种可能性。一种是Pyk2磷酸化E-cadherin另外一种就是-cadherin抑制Pyk2磷酸激酶活性。我们认为第一种可能性较大。有文献报道，Pyk2磷酸化VE-cadherin（E-cadherin同源家族成员）并且抑制其与，P120等成复合体[VE-cadherin源性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin该也有可能磷酸化E-cadherin此我们有理由推测于肿瘤始动因素的作用Pyk2表增多，活性增强，从而磷酸E-cadherin，E-cadherin降，最终使细胞迁移性增强。但是也不能排除第二种可能性，E-cadherin抑制Pyk2磷酸激酶活性，从而导致肿瘤细胞侵袭性下降。申请人以前的工作就发现钙粘附蛋白家族的另外一个成员γProtocadherins能够抑制P的活性[请人做这方面工作时曾取E-cadherin做比参照，结果发现抑Pyk2激活性不是很明显（本数据未发表此不支持第二种可能性。二者具体如何调节还需要进一步实验来证实。本课题的设计主要是为了解答上述问题。首先在前期工作基础上继续明确Pyk2与E-cadherin能相互作用以及调节机制；其次应用细胞迁移实验确定二者的调节对肿瘤细胞迁移、侵袭性的影响；然后应用裸鼠成瘤转移实验明确二者的调节在对肝癌远处转移的影响；最后分析在肝癌病人组织标本中二者表达的相关性以及与转移的相关性。本课题在国际上最新发现Pyk2与E-cadherin直接相互作用，并且确定其结合机制，明确这种调节与肝癌细胞迁移力和肿瘤转移的关系对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解。许多新型抗癌药物如赫赛汀、格列卫、吉非替尼、厄洛替尼都是以酪氨酸激酶第页国家自然科基金申请2010版为治疗靶点，取得非常好的疗效。本研究对于确定E-cadherin和酪氨酸激酶Pyk2做为分子治疗靶点、设计合理的治疗药物可以提供更有利的素材。参考文献：[1]HeJ,GuD,X,al.MajorcausesofamongmenandwomeninChina.EnglJMed–34.[2]吴，廖美琳，陆嘉德常性肿瘤治疗进展上科技育出版社2007[3]BryantDM,StowJL.TheinsandoutsofE-cadherintrafficking.TrendsCellBiol.2004Aug;14(8):427-34[4]WellsA,C,CR.E-cadherinasanindicatoroftoepithelialrevertingtransitionsduringthemetastaticseedingofdisseminatedcarcinomas.ClinExpMetastasis.2008;25(6):621-8.Epub2008[5]SalonC,LantuejoulS,EyminB,etal.TheE-cadherin-beta-catenincomplexanditsimplicationinlungcancerprogressionandprognosis.FutureOncol.2005Oct;1(5):649-60[6]HowardEW,CammKD,WongYC,etal.E-cadherinupregulationasatherapeuticgoalintreatment.MiniRevMedChem.May;8(5):496-518.[7]GuoLiuQG,al.RelationamongE-cadherinandbeta-cateninexpression,clinicopathologicsignificanceandprognosisinhumanhepatocellularcarcinoma.HepatobiliaryDisInt.2008Oct;7(5):490-6.[8]ZhaiB,YanHX,LiuSQ,etal.ReducedexpressionofE-cadherin/catenininhepatocellularcarcinomas.WorldGastroenterol.2008Oct7;14(37):5665-73.[9]FransveaE,AngelottiU,AntonaciS,etal.Blockingtransforminggrowthfactor-betaup-regulatesE-cadherinreducesmigrationinvasionofhepatocellularcarcinomacells.2008May;47(5):1557-66.[10]OsadaT,InoY,etal.E-cadherininvolvedintheintrahepaticmetastasishepatocellularHepatology.Dec;24(6):1460-7[11]AuerkariMethylationoftumorsuppressorp16(INK4a),p27(Kip1)andE-cadherinincarcinogenesis.OralOncol.2006Jan;42(1):5-13.[12]Y,VanNhieuJT,PrigentS,etal.AlteredexpressionofE-cadherininhepatocellularcarcinoma:Correlationswithgeneticalterations,β-cateninexpression,andclinicalfeaturesHepatology2002Sep;36(3):692-701[13]J,NiXual.Methylationprofilingofpromoter-CpGislandswhichmaycontributetohepatocellularcarcinogenesis.BMC2002,2:29[14]FujitaKrauseG,ScheffnerM,Hakai,etal.ac-Cbl-likeprotein,ubiquitinatesandinducesendocytosisoftheE-cadherincomplex.NatCellBiol.2002Mar;4(3):222-31.[15]YapS.sosimple:thecomplexityphosphotyrosinesignalingatcadherincontacts.JMol85:545-554.[16]H,ParkSY,SchinkmannK,etal.RAFTK/Pyk2-mediatedcellularsignalling.CellSignal.2000Mar;12(3):123-33.[17]BehmoaramE,BijianK,S,al.kinase-relatedproline-richtyrosinekinase2andfocaladhesionkinaseareco-overexpressedinearly-stageandinvasive第页国家自然科基金申请2010版ErbB-2-positivebreastandcooperateforbreastcelltumorigenesisandinvasiveness.AmJPathol.Nov;173(5):1540-50.[18]IiizumiM,BandyopadhyayS,Paial.RhoCpromotesmetastasisviaactivationofthePyk2inprostatecancer.Res.15;68(18):7613-20.[19]CK,K,Ngal.Proline-richtyrosinekinase2promotesproliferationandinvasivenessofhepatocellularcarcinomacellsthroughc-Src/ERKactivation.Carcinogenesis.Nov;29(11):2096-105.[20]CK,NgBS,al.Thesignificanceofproline-richtyrosinekinase2(Pyk2)onhepatocellularcarcinomaprogressionandrecurrence.BrJCancer.2007Jul2;97(1):50-7.[21]ZhangX,XuLH,Q.CellaggregationinducesphosphorylationofandPyk2andtumorcellgrowth.Mol14;9:7[22]S,GuoD,JiangL,etal.inhibitingmigrationcellscorrelateswithPYK2signalinginvitro.2008;8:150.[23]VitaleGentiliniD,AbbruzzeseA,etal.Pyk2Cyr61atthecross-roadofcAMP-dependentsignallinginvasivenessandneuroendocrinedifferentiationofprostatecancer.BiolTher.2009;8[24]TurowskiP,MartinelliR,CrawfordR,etal.Phosphorylationofvascularendothelialcadherincontrolslymphocyteemigration.JCellSci.1;121(Pt1):29-37.[25]PotterMD,BarberoS,ChereshTyrosinephosphorylationofVE-cadherinbindingp120-andbeta-cateninandmaintainscellularmesenchymalstate.JBiolChem.2005Sep9;280(36):31906-12.[26]JianChen,LuY,MengS,etal.alpha-andgamma-ProtocadherinsNegativelyRegulatePYK2.JBiolChem.2009Jan30;284(5):2880-90第页国家自然科基金申请2010版（）目研内、究标及解的键学题１.主要究容1确定E-cadherin与Pyk2体外、体相互作用、用位点及调节关系A．取E-cadherin与Pyk2不结构域和不同突变体，应用酵母双杂交Down以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域，以及作用位点。选取二者表达量都适中的肝癌组织行源性免疫共沉淀证在体内二者也相互作用。应用免疫荧光技术和蔗糖密度梯度超速离心方法分析细胞组分的方法确定E-cadherin与Pyk2在胞中共定位。应用磷酸化实验定E-cadherin是否是Pyk2的底物用定点突变的方法，确定酪氨酸的磷酸化位点再次确证E-cadherin能否影响Pyk2激酶活性2从细胞平确定Pyk2对E-cadherin的调节影细胞迁。筛选Pyk2稳表达细胞株应用Transwell细胞迁移实验观察过表达Pyk2的细胞其迁移性、侵袭性的变化，检测过表达Pyk2时E-cadherin的磷酸化状态和蛋白水平的变化，确定Pyk2对E-cadherin磷酸化状态的调节影响细胞迁移。取高转移肝癌细胞株MHCC97-H(购自上海中山医院肝癌研究所)，应用RNAi技术沉默Pyk2的表达，观察细胞迁移性、侵袭性的变化，检测相应状态下E-cadherin的磷酸化状态和表达水平的变化。从相反方向确定Pyk2的表达抑制后对E-cadherin磷酸化状态的调节，以及这种调节对细胞迁移的影响。3从动物型水平确定Pyk2对E-cadherin的调节影响瘤转移应用Pyk2稳表达细胞株接种裸鼠察鼠肿瘤肺转移肝转移情况析Pyk2的过表达对E-cadherin磷酸化状态的调节关系，以及与肿瘤转移的相关性。4）从肝癌人标本寻找Pyk2与E-cadherin磷酸化状的相关，以及肿瘤转移的相关性。收集肝癌标本，应用免疫组化和Western等方法确定Pyk2的表达水平的变化与E-cadherin磷酸化状态和蛋白水平的相关性，以及二者与肿瘤转移的相关性。２.研究标确定Pyk2结合E-cadherin相互作用的结构域及磷酸化位点，并阐明其调节机制。确定Pyk2与E-cadherin的调节可影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移。３.拟解的键学题E-cadherin酪氨酸残基的磷酸化导致其被降解，增加细胞侵袭性。本课题能够确第页国家自然科基金申请2010版定酪氨酸激酶Pyk2能否磷酸化E-cadherin，Pyk2与E-cadherin的调节是否是调节肿瘤细胞转移的新的分子机制。（）采的究案可性析１.研究法GST-pulldown，荧光共定位，内源、外源免疫共沉淀，蔗糖密度梯度超速离心，磷酸化实验，定点突变，稳定表达细胞株的筛选，抑制Pyk2达，细胞迁移、侵袭实验，裸鼠成瘤肿瘤转移实验，免疫组化，定量PCR，Western检测等。２.关键术明1磷酸化实验首先应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为阳性参照，以纯化的GST-E-cadherin蛋白为底物，以GST蛋白作为阴性对照，观察Pyk2是否可以磷酸化E-cadherin。如果能磷酸化E-cadherin则应用生物信息分析，定点突变，寻找磷酸化位点；如果不能磷酸化E-cadherin则以通用底物E4Y1作为底物，加入不同量的E-cadherin观察是否可以影响Pyk2的激酶活性。2细胞迁移实验首先分别用空载体PCDNA3.1，PCDNA3.1-Pyk2-Myc转染肝癌细胞株（PRNK为Pyk2的段为Pyk2的活突变体筛选出稳定表达细胞株。并检测稳定表达细胞株Pyk2白表达量的不同。然后应用稳定表达细胞株做Transwell细胞迁移和侵袭实验较细胞迁移率的变化测细胞迁移率的变化与Pyk2蛋表达量的关系时取相应细胞做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平

、蛋白水平、酸化水平的变化以及这些变化与肿瘤迁移的关系，与Pyk2蛋白表达量的关系。3裸鼠成瘤肿瘤转移实验取上述三组稳定表达细胞株分别接种裸鼠，待肿瘤直径约1-1.5cm时取出肿瘤重新接种于另外一批裸鼠的肝左叶。接种5星左右处死裸鼠，收集肝脏和肺脏，观察肝内转移情况和肺转移情况。检测三组肿瘤Pyk2蛋白表达量的不同以及与肿瘤转移的关系同时取相应肿瘤做定量PCR蛋白定量磷化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平

、

蛋白水平

、酸化水平的变化，确定这些变化与肿瘤转移的关系，与Pyk2蛋表达量的关系。4蔗糖密度梯度超速离心定位和内源免疫共沉淀取肝癌肿瘤的癌旁组织，裂解离心，取裂解液上清，蔗糖密度梯度超速离心。取离心后的不同组分样品做Western，分别用E-cadherin抗体和Pyk2抗体作为一抗检第10页国家自然科基金申请2010版测。如果二者表达最多的峰值是在同一个组分中，则提示我们二者在细胞内是共定位的。取上述二者的表达较多的组分Pyk2单免疫沉淀（免疫球蛋白作对照然后用E-cadherin单抗杂交检测E-cadherin是否能与Pyk2共淀下来反方向则是：用E-cadherin单免疫沉淀E-cadherin（疫球蛋白作对照用Pyk2单抗杂交检测Pyk2是能与E-cadherin共沉淀下来。３.技术线定点突变，GST-pulldown，免疫共沉淀等方法验证确定相互作用的结构域以及位点荧光共定位，免疫组化，蔗糖密度梯度超速离心等方法验证在细胞以及肿瘤组织中共定位磷酸化实验确是否是Pyk2的酸化底物以及磷酸化位点

筛选稳定表达Pyk2肝癌细胞株，检测Pyk2蛋白表达与E-cadherin磷化水平的关系。细胞迁移实验:Pyk2白过表达和RNAi抑制时与E-cadherin磷酸化水平、细胞迁移的关系。裸鼠成瘤转移实验蛋白表达量、E-cadherin磷酸化水平与肿瘤转移的关系。

收集肝癌病人标本和临床资料免疫组化Western等方法检测E-cadherin蛋白水平、磷酸化状态P表达量的相关性，以及与肝癌转移的相关性。汇总分析数据：揭示Pyk2磷酸化制；揭示通过磷酸化影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。左侧部分：取E-cadherin与Pyk2不同结构域和不同突变体，应用酵母双杂交、GST-PullDown以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域及作用位点。荧光共定位，免疫组化，蔗糖密度梯度超速离心等方法验证二者在细胞以及肿瘤组织中共定位酸化实验确定E-cadherin是Pyk2的磷酸化底物磷酸化位点。这部分内容从生化的角度确定Pyk2磷酸E-cadherin的分子机制。中间部分过细胞迁移实验鼠成瘤转移实验从细胞水平物模型确定Pyk2通过磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。右侧部分：收集肝癌病人标本和临床资料，通过免疫组化、Western等方法检测E-cadherin/Pyk2蛋白水平、磷酸化状态，分析二者表达量的相关性，以及与肝癌第11页国家自然科基金申请2010版转移的相关性。4.最下面部分为汇总数据，总结分析。4.可行分）前验经酵双、GST-PullDown、共淀证实了E-cadherin与Pyk2相互作用(见研究基础部分)，而且二者功能上密切相关。E-cadherin作为一种细胞黏附分子在细胞黏附、细胞迁移和接触抑制方面具有作用。而Pyk2能通过各种信号途径参与调节细胞黏附、扩散和迁移等过程。因此，二者在功能上是有互相作用基础的。考虑到Pyk2是个激酶蛋白，且前期实验结果提示yk2激区域结合E-cadherin有两种可能是yk2磷化E-cadherin一种是-cadherin抑制Pyk2酶活性。我们认为第一种可能性较大。根据文献报道，Pyk2磷酸化E-cadherin的源蛋白E-cadherin且抑制其与Catenin、P120形成复合体，从而影响细胞迁移。E-cadherin与E-cadherin同性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin该就有可能磷酸化E-cadherin此我们有理由推测于肿瘤始动因素的作用表增多性增强而磷酸化E-cadherin致E-cadherin降解，最终使细胞迁移性增强。我们上述实验设计基本基于这个逻辑。磷酸化实验证实Pyk2磷化E-cadherin，致E-cadherin蛋减少。细胞迁移实验和动物实验设计逻辑是通过Pyk2表达，检测E-cadherin磷化增强，蛋白量减少，导致细胞迁移增强或者肿瘤转移增加；RNAi制Pyk2的表，则出现相反的结果，E-cadherin磷酸化减弱，蛋白量增加，导致细胞侵袭性减弱和肿瘤肺转移减少。事实是否如此，需要实验来证明。申请人以前的工作曾发现钙粘附蛋白家族的另外一个成员γ-Protocadherins能够抑制Pyk2的活性，因此从逻辑上讲也不能完全排除第二种可能性，即E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。如果是这样的话，则可能的假设是：在正常细胞中，E-cadherin抑制Pyk2的活性瘤条件下其他原因E-cadherin减少或消失，而不能抑制Pyk2活性，导致Pyk2活性增强，因而肿瘤细胞迁移性增强。如果基于这个逻辑的话，实验设计就要改变为：磷酸化实验时应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为底物察E-cadherin对Pyk2激活性是否有抑制作用后筛选E-cadherin过表达、功能失活突变体和空载体的稳定表达肝癌细胞株，然后行细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验，观察E-cadherin蛋白过表达或功能失活突变后与细胞迁移或者肿瘤转移的关系，同时检测其与Pyk2蛋白表达量及磷酸化水平相关性。但是申请人在完成γ-Protocadherins抑制Pyk2的活性的工作中曾取E-cadherin做对比参照，结果发现E-cadherin抑制Pyk2激酶活性不是很明显，因此这种可能性不大。从上面的分析来看，本课题在理论和逻辑上是可行的。第12页国家自然科基金申请2010版本课题是本人前期工作的延续，本人对E-cadherin/Pyk2的究非常熟悉，前期工作构建的质粒表达载体等为本课题的下一步研究提供了很多有利的条件。本课题组的成员对所需要的技术方法都很熟练，且都有相应的工作基础，可以在各个方面进行协作。本课题所涉及的技术均为较成熟的技术，所需的设备和条件本校都具备。（）课的色创之本课题通过酵母双杂交新发现一个与E-cadherin相互作用的蛋白--非受体型酪氨酸激酶Pyk2，并证明两者的相互作用可靠，国内外研究至今未曾见过报道，具有国际先进性和独创性报道二者的表达量与肿瘤转移的关系，但是二者直接相互作用未见报道本课题新发现Pyk2磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞转移的机制，对于E-cadherin在肝癌转移过程中的分子机制有新的理解，因此具有独创性和先进性。（）度究划预研结1.年度究划2011.01-2011.12磷酸化实验确定二者的调节关系，肝癌组织内源免疫共沉淀确定相互作用可靠，同时确定二者结合的结构域，磷酸化位点。蔗糖密度梯度超速离心，荧光共定位等相关的实验进一步确证二者共定位。同时收集病例标本，收集临床资料。纯化蛋白制备抗体。2012.01-2012.12

细移实验，鼠成瘤肿瘤移实验检Pyk2的表达与E-cadherin的磷酸化状态，以及细胞迁移的关系，确定其调节机制。同时完成E-cadherin/Pyk2的达以及磷酸化状态与肝癌的分期、转移、预后、复发等临床指标的相关性分析。2013.01-2013.12补充实验遗漏，整理实验资料，统计处理实验数据，撰写论文。2.预期究果1)定Pyk2能磷酸化E-cadherin者相互作用的结构域以及磷酸化位点。2)定Pyk2通磷酸化E-cadherin从而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移。确定在肝癌组织中E-cadherin蛋白水平、磷酸化状态和Pyk2达量的相关性，以及二者的表达与肝癌转移的相关性。在国外学术期刊上发表SCI论文2-4，其中影响因子大于5有一篇以上。在国内核心期刊发表论文2-4篇，并在国内外学术会议交流。培养研究生2-3名二研基与作件（）研基第13页国家自然科基金申请2010版第一步为了研究肝癌转移的机制首先选取（内段以下实验同）为诱饵在肝脏的cDNA文库中做酵母双杂交寻与E-cadherin相作用的蛋白们先选取的是LACZ统蓝白斑筛选，但是因为背景高而放弃。后来选取CytoTRAP统，背景明显减低，测序后有意义的基因31个。其中4为Pyk2片。通过克Pyk2因全长验证，确定二者在酵母中的相互作用是强阳性的（图1yk2的同源蛋白FAKE-cadherin互作用为可疑弱阳性图1酵双杂交系验证yk2与-cadherin作用pMyr-Lamin为对照pMyr-SB为性照E-CadE-Cadherin写以示与此相同。为饵蛋系母双杂交点为两个蛋白如果不相互作用25时可以生长，而3℃不生如阴性对Myr-Lamin所两个蛋白如果相互作用则在两个温度下都能生如对pMyr-SB示pMyr-Pyk2性对照相似。第二步：原核表达E-cadherin和is-Pyk2进行GST-Pulldown。为了验证二者是直接结合，我们分别细菌中表达纯GST-E-cadherin和His-Pyk2可His-Pyk2全非常难纯化得不到纯化的蛋白们表达纯化了His-Pyk2的酶部分GST-Pulldown实验结果证实Pyk2激酶部分能够与E-cadherin直结合（图2泳道123第14页国家自然科基金申请2010版图2原表E和is-Pyk2激分进G分别原核表ST和激分GST分别与相同量H激酶部分混合入谷胱甘肽琼脂珠孵育复