青岛科技大学环境微生物4第四章-微生物的遗传与变异课件

第四章微生物的遗传与变异4.1微生物的遗传4.2微生物的变异4.3微生物基因重组4.4人工构建新菌株4.5菌种的衰退、复壮与保藏第四章微生物的遗传与变异4.1微生物的遗传14.1微生物的遗传遗传的概念营养类型和环境条件传给后代。遗传的保守性：遗传不可改变的一面。遗传的变异性：环境迁移，产生适应新环境的酶，适应新环境4.1微生物的遗传遗传的概念2遗传的物质基础DNA格里菲斯实验遗传物质在微生物中的存在染色体：所有微生物DNA的主要存在形式细胞器：真核微生物质粒遗传的物质基础34.2微生物的变异微生物的变异与基因突变变异：非遗传性变异未改变微生物的DNA变异可逆遗传性变异DNA发生改变变异不可逆相对稳定的遗传下来基因突变：生物细胞遗传物质DNA分子结构突然发生了稳定的可遗传的变化。4.2微生物的变异微生物的变异与基因突变4发生随机性，结果无定向性频率稀有性，可诱变性可逆性稳定性基因突变的特点发生随机性，结果无定向性基因突变的特点5Luria等的变量试验Newcombe的涂布试验J.Lederberg等设计的平板影印培养法Luria等的变量试验Newcombe的涂布试验J.Le64.2微生物的变异突变类型按突变导致的表型改变分为：形态突变型、生化突变型、致死突变型和条件致死突变型按突变的条件和原因划分自发突变：在自然条件发生的。诱发突变：利用诱变剂引起的基因突变。。4.2微生物的变异突变类型7物理诱变利用物理因素化学诱变利用化学物质复合处理及协同效应物理化学诱发突变物理诱变诱发突变84.3微生物基因重组4.3.1概念：两个不同性状的个体细胞的DNA融合，使基因重新组合，从而发生遗传变异产生新品种。4.3.2原核微生物的基因重组细菌接合转导转化原生质体融合（4.4中介绍）4.3微生物基因重组4.3.1概念：两个不同性状的个体细胞的9接合

（合作）

细菌有性生殖接合：是细菌通过性菌毛将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。接合（合作）细菌有性生殖接合：是细菌通过性菌毛将遗传物质10转导是1951年辛德尔(Zinder)和莱德贝尔格(1Jederberg)在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发现的。转导是以温和噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，使受体菌获得新的性状。转导是1951年辛德尔(Zinder)和莱德贝尔格(11LA-2A-B+LA-22A+B-LA-2是能合成色氨酸（B+）但不能合成组氨酸（A-）的沙门氏伤寒杆菌

指导色氨酸合成的基因超微烧结玻璃板细菌不能通过，噬菌体可以通过转导能合成色氨酸间谍侵入、重组“转移、导手”LA-22是

合成色氨酸（B-）但能合成组氨酸（A+）的沙门氏伤寒杆菌一些细胞中含有繁殖速度较慢的温和噬菌体P-22不能LA-2A-B+LA-22A+B-LA-2是能合成色氨酸12转化Transformation（引进）转化现象是1928年英国的细菌学家格里菲斯首先发现的,，被命名为格里菲斯实验（证明DNA是生命遗传物质的经典实验之一）。供体菌受体菌DNA片段转化Transformation（引进）转化现象是1928年13老鼠体内提取物培养现象活的SⅢ肺炎双球菌活的RⅡ

肺炎双球菌

无毒

杀死

杀死

转化现象加热杀死后的破碎细胞混合注射加热杀死后的破碎细胞格里菲斯实验无毒注射注射？？老鼠体内提取物培养现象活的SⅢ肺炎双球菌活的RⅡ141944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白质⑥加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。M15转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）16转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；b）不需要活的DNA供体细胞；c）转化效率取决于转化菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多转化过程的特点：174.3微生物基因重组4.3.3真核微生物的基因重组有性杂交准性生殖菌丝联结形成异核体核融合体细胞交换酵母菌染色体外的DNA重组4.3微生物基因重组4.3.3真核微生物的基因重组18有性杂交细胞（＋）细胞（－）有性接合染色体重组新遗传型能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交有性杂交细胞（＋）有性接合染色体重组19准性杂交细胞（＋）细胞（＋）准性接合基因重组新遗传型菌丝联结质配核配有丝分裂交换单倍体杂合子在半知菌类中最为常见半知菌的准性生殖准性杂交细胞（＋）准性接合基因重组20酵母菌染色体外的DNA重组2µm质粒线粒体DNA酵母菌染色体外的DNA重组214.4人工构建新菌株4.4.1诱变育种-诱变育种的原则-诱变方法4.4人工构建新菌株4.4.1诱变育种221.诱变育种的原则（1）使用简便有效的诱变剂诱变剂物理因素化学因素紫外线激光离子束X射线r射线快中子烷化剂碱基类似物吖啶化合物1.诱变育种的原则诱变剂物理因素化学因素紫外线烷化剂23（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液（4）使用最佳诱变剂量剂量=强度（浓度）×作用时间相对剂量=杀菌率（5）利用协同效应（6）变异菌株的筛选（2）选用优良的出发菌株24常用的诱变剂：紫外线、5—溴尿嘧啶、烷化剂、亚硝酸、卟啶染料等。诱变的步骤Ⅰ.制出发菌株的单细菌悬浮液Ⅱ.选择合适的诱变剂剂量进行诱变Ⅲ.筛选突变出的高效菌

2.诱变方法常用的诱变剂：紫外线、5—溴尿嘧啶、烷化剂、亚硝酸、卟啶染料25突变株的筛选方法诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）逐个检出法影印平板法生长谱法突变株的筛选方法诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富26诱变正变率多数未变少数突变多数负变少数正变多数幅度小少数幅度大“高产率”多数不宜投产少数适宜投产“投产率”可计算：出发菌株

绝大多数个体死亡少数存活存活率突变率诱变正变率多数未变少数突变多数负变少数正变多数幅度小少27通常生产上更多利用的是诱导法。通过驯化，能产生诱导酶的菌株被保留下来，且能力逐步提高。通常生产上更多利用的是诱导法。284.4人工构建新菌株4.4.2原生质体融合概念：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。4.4人工构建新菌株4.4.2原生质体融合29青岛科技大学环境微生物4第四章--微生物的遗传与变异课件30原生质体融合的优点：可以提高重组率遗传物质的传递更为完整重组体种类较多

有利于不同种间、属间微生物的杂交通过原生质体融合提高产量原生质体融合的优点：31微生物原生质体融合的过程①标记菌株的筛选；②原生质体的制备；③原生质体的融合；④融合子的选择；⑤原生质体的再生；⑥实用性菌株的筛选。

微生物原生质体融合的过程①标记菌株的筛选；32选择亲株

选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等原生质体制备

去除细胞壁是制备原生质体的关键

选择亲株选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株带有可33原生质体融合聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合一般PEG的使用浓度范围在25-40%采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合原生质体再生使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构原生质体融合聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合采用34不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压再生率

细菌为3-10%真菌在20-80%

融合重组子的筛选通过两亲株遗传标记的互补而得以识别两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是35重组子的检出方法有两种：

直接法

将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子

间接法

把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。重组子的检出方法有两种：直接法将融合液涂布在不补充亲株生36青岛科技大学环境微生物4第四章--微生物的遗传与变异课件374.4人工构建新菌株基因工程概念：在基因水平上的遗传工程，供体DNA切割后，与载体连接，导入某一受体细胞中，获得新品种。

体外切割导入遗传物质基因片段受体细胞4.4人工构建新菌株基因工程38获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定应用基因工程的基本操作获得目的基因基因工程的基本操作39在特殊培养基上（如含有青霉素）筛选目的细菌质粒载体（具有抗性基因）如抵抗青霉素长出必然是重组成功的细菌外源基因片段详见《生物化学》有关章节在特殊培养基上（如含有青霉素）筛选目的细菌质粒载体（具有抗性40对特殊基因进行“剪切－粘贴－链接”制造“超级细菌”++对特殊基因进行“剪切－粘贴－链接”制造“超级细菌”++41Ⅰ.降解石油的工程细菌查氏将能降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作受体细菌，分别将能降解芳烃(质粒B)、芳烃(质粒C)和多环芳烃(质粒D)的质粒，用遗传工程方法人工转入受体细菌，获得多质粒“超级细菌”，可除去原油中2／3的烃。浮油在一般条件下降解需一年以上时间，用“超级细菌”只需几小时即可把浮油去除，速度快效率高。基因工程的应用Ⅰ.降解石油的工程细菌基因工程的应用42Ⅱ.耐汞工程菌恶臭假单胞菌一般在超过2ug／ml汞浓度中即将中毒死，查克拉巴蒂用质粒转移技术，把嗜油假单胞菌的耐汞质粒(MER质粒)转移到恶臭假单胞菌中去，后者获得MER质粒，可在50~70ug／ml氯化汞中生长。Ⅲ．脱色工程菌的构建将分别含有降解偶氮染料质粒的偏号Kx和Kd两株假单胞菌通过质粒转移技术培育出兼有分解两种偶氮染料功能的脱色工程菌。Ⅱ.耐汞工程菌434.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮-衰退（degeneration）：在微生物的生长过程中，由于变异的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。4.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮44复壮(rejuvenation)：狭义从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义是指在菌种未衰退前就有意识进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。复壮(rejuvenation)：狭义从衰退的群体中找出未衰454.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变纯菌种不纯菌种突变个体原始个体衰退菌种4.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮菌种衰退的原因464.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮防止衰退的措施减少传代次数；创造良好的培养条件；利用单核体传代经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；采用有效的菌种保藏方法；4.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮474.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮菌种的复壮纯种分离

通过寄主体进行复壮

淘汰已衰退的个体

4.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮484.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种保藏目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用基本原则：挑选典型菌种的优良纯种尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株

4.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种保藏494.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种保藏基本方法培养基传代培养（斜面、平板）寄主传代培养真空冷冻干燥法沙土管干燥生活态休眠态石蜡油封藏法

低温（液氮、低温冰箱）

4.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种保藏基本方法培养基传代培养（50几种常用菌种保藏方法的比较几种常用菌种保藏方法的比较51思考题基因突变的特点是什么？简述原核微生物基因重组的机理？人工构建新菌株的方法有哪些？菌种衰退和复壮的概念是什么？菌种的保存方法有哪些？思考题基因突变的特点是什么？52冷冻干燥保藏法和液氮保藏法冷冻干燥保藏法和液氮保藏法53影印试验(replicaplating)影印试验(replicaplating)54（六）紫外线对DNA的损伤及其修复嘧啶嘧啶二聚体UV1、光复活作用嘧啶二聚体嘧啶光解酶（六）紫外线对DNA的损伤及其修复嘧啶嘧啶二聚体UV1、光复55青岛科技大学环境微生物4第四章--微生物的遗传与变异课件56二、不同对象的细胞工程（一）微生物细胞工程1、定义：微生物细胞工程应用微生物进行细胞水平的研究与生产，具体内容包括各种微生物细胞的培养、遗传性状的改造、微生物细胞的直接利用或获得细胞代谢产物等。2、细胞融合基本过程原生质体的制备→融合重组→原生质体再生成细胞→融合重组的测定二、不同对象的细胞工程（一）微生物细胞工程57（1）原生质体的制备酶解法质生质体的形成率＝原生质体数/未经酶处理的总菌数。①革兰氏阳性菌：溶菌酶，肽聚糖中N－乙酰胞壁酸与N－乙酰葡萄糖胺之间的β－1,4－糖苷键

②革兰氏阴性菌：溶菌酶+(数分钟后）0.1mol/L的EDTA共同作用15－20min，则可使90%以上的革兰氏阴性菌转变为可供细胞融合用的球状体。③真核细胞：消解酶、蜗牛酶、纤维素酶、几丁质酶等处理，原生质体得率在90%以上。二、不同对象的细胞工程（1）原生质体的制备二、不同对象的细胞工程58注意：原生质体制备后必须用渗透压稳定剂维持其稳定性。（2）融合重组p146图4－6注意：原生质体融合重组作为基因声称的一种有效方法，需经历三个主要阶段：细胞融合形成异核体、不同核融合产生二倍体、融合核交换和重组生成重组体（3）原生质体再生成细胞

二、不同对象的细胞工程注意：原生质体制备后必须用渗透压稳定剂维持其稳定性。二、不59置于高渗再手固体培养基中。再生频率＝（原生质体再生细胞数/总菌落数）×100%(主要是利用原生质体对渗透压的敏感性）（4）融合重组的测定

①直接法：不补充两亲株生长所需营养物或补充两种药物

②间接法:亲株和重组子都再生，然后用影印法复制到选择培养基上以检出重组子。融合频率＝融合子数/再生的原生质体数二、不同对象的细胞工程置于高渗再手固体培养基中。二、不同对象的细胞工程60第四章微生物的遗传与变异4.1微生物的遗传4.2微生物的变异4.3微生物基因重组4.4人工构建新菌株4.5菌种的衰退、复壮与保藏第四章微生物的遗传与变异4.1微生物的遗传614.1微生物的遗传遗传的概念营养类型和环境条件传给后代。遗传的保守性：遗传不可改变的一面。遗传的变异性：环境迁移，产生适应新环境的酶，适应新环境4.1微生物的遗传遗传的概念62遗传的物质基础DNA格里菲斯实验遗传物质在微生物中的存在染色体：所有微生物DNA的主要存在形式细胞器：真核微生物质粒遗传的物质基础634.2微生物的变异微生物的变异与基因突变变异：非遗传性变异未改变微生物的DNA变异可逆遗传性变异DNA发生改变变异不可逆相对稳定的遗传下来基因突变：生物细胞遗传物质DNA分子结构突然发生了稳定的可遗传的变化。4.2微生物的变异微生物的变异与基因突变64发生随机性，结果无定向性频率稀有性，可诱变性可逆性稳定性基因突变的特点发生随机性，结果无定向性基因突变的特点65Luria等的变量试验Newcombe的涂布试验J.Lederberg等设计的平板影印培养法Luria等的变量试验Newcombe的涂布试验J.Le664.2微生物的变异突变类型按突变导致的表型改变分为：形态突变型、生化突变型、致死突变型和条件致死突变型按突变的条件和原因划分自发突变：在自然条件发生的。诱发突变：利用诱变剂引起的基因突变。。4.2微生物的变异突变类型67物理诱变利用物理因素化学诱变利用化学物质复合处理及协同效应物理化学诱发突变物理诱变诱发突变684.3微生物基因重组4.3.1概念：两个不同性状的个体细胞的DNA融合，使基因重新组合，从而发生遗传变异产生新品种。4.3.2原核微生物的基因重组细菌接合转导转化原生质体融合（4.4中介绍）4.3微生物基因重组4.3.1概念：两个不同性状的个体细胞的69接合

（合作）

细菌有性生殖接合：是细菌通过性菌毛将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。接合（合作）细菌有性生殖接合：是细菌通过性菌毛将遗传物质70转导是1951年辛德尔(Zinder)和莱德贝尔格(1Jederberg)在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发现的。转导是以温和噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，使受体菌获得新的性状。转导是1951年辛德尔(Zinder)和莱德贝尔格(71LA-2A-B+LA-22A+B-LA-2是能合成色氨酸（B+）但不能合成组氨酸（A-）的沙门氏伤寒杆菌

指导色氨酸合成的基因超微烧结玻璃板细菌不能通过，噬菌体可以通过转导能合成色氨酸间谍侵入、重组“转移、导手”LA-22是

合成色氨酸（B-）但能合成组氨酸（A+）的沙门氏伤寒杆菌一些细胞中含有繁殖速度较慢的温和噬菌体P-22不能LA-2A-B+LA-22A+B-LA-2是能合成色氨酸72转化Transformation（引进）转化现象是1928年英国的细菌学家格里菲斯首先发现的,，被命名为格里菲斯实验（证明DNA是生命遗传物质的经典实验之一）。供体菌受体菌DNA片段转化Transformation（引进）转化现象是1928年73老鼠体内提取物培养现象活的SⅢ肺炎双球菌活的RⅡ

肺炎双球菌

无毒

杀死

杀死

转化现象加热杀死后的破碎细胞混合注射加热杀死后的破碎细胞格里菲斯实验无毒注射注射？？老鼠体内提取物培养现象活的SⅢ肺炎双球菌活的RⅡ741944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白质⑥加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。M75转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）76转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；b）不需要活的DNA供体细胞；c）转化效率取决于转化菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多转化过程的特点：774.3微生物基因重组4.3.3真核微生物的基因重组有性杂交准性生殖菌丝联结形成异核体核融合体细胞交换酵母菌染色体外的DNA重组4.3微生物基因重组4.3.3真核微生物的基因重组78有性杂交细胞（＋）细胞（－）有性接合染色体重组新遗传型能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交有性杂交细胞（＋）有性接合染色体重组79准性杂交细胞（＋）细胞（＋）准性接合基因重组新遗传型菌丝联结质配核配有丝分裂交换单倍体杂合子在半知菌类中最为常见半知菌的准性生殖准性杂交细胞（＋）准性接合基因重组80酵母菌染色体外的DNA重组2µm质粒线粒体DNA酵母菌染色体外的DNA重组814.4人工构建新菌株4.4.1诱变育种-诱变育种的原则-诱变方法4.4人工构建新菌株4.4.1诱变育种821.诱变育种的原则（1）使用简便有效的诱变剂诱变剂物理因素化学因素紫外线激光离子束X射线r射线快中子烷化剂碱基类似物吖啶化合物1.诱变育种的原则诱变剂物理因素化学因素紫外线烷化剂83（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液（4）使用最佳诱变剂量剂量=强度（浓度）×作用时间相对剂量=杀菌率（5）利用协同效应（6）变异菌株的筛选（2）选用优良的出发菌株84常用的诱变剂：紫外线、5—溴尿嘧啶、烷化剂、亚硝酸、卟啶染料等。诱变的步骤Ⅰ.制出发菌株的单细菌悬浮液Ⅱ.选择合适的诱变剂剂量进行诱变Ⅲ.筛选突变出的高效菌

2.诱变方法常用的诱变剂：紫外线、5—溴尿嘧啶、烷化剂、亚硝酸、卟啶染料85突变株的筛选方法诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）逐个检出法影印平板法生长谱法突变株的筛选方法诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富86诱变正变率多数未变少数突变多数负变少数正变多数幅度小少数幅度大“高产率”多数不宜投产少数适宜投产“投产率”可计算：出发菌株

绝大多数个体死亡少数存活存活率突变率诱变正变率多数未变少数突变多数负变少数正变多数幅度小少87通常生产上更多利用的是诱导法。通过驯化，能产生诱导酶的菌株被保留下来，且能力逐步提高。通常生产上更多利用的是诱导法。884.4人工构建新菌株4.4.2原生质体融合概念：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。4.4人工构建新菌株4.4.2原生质体融合89青岛科技大学环境微生物4第四章--微生物的遗传与变异课件90原生质体融合的优点：可以提高重组率遗传物质的传递更为完整重组体种类较多

有利于不同种间、属间微生物的杂交通过原生质体融合提高产量原生质体融合的优点：91微生物原生质体融合的过程①标记菌株的筛选；②原生质体的制备；③原生质体的融合；④融合子的选择；⑤原生质体的再生；⑥实用性菌株的筛选。

微生物原生质体融合的过程①标记菌株的筛选；92选择亲株

选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等原生质体制备

去除细胞壁是制备原生质体的关键

选择亲株选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株带有可93原生质体融合聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合一般PEG的使用浓度范围在25-40%采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合原生质体再生使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构原生质体融合聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合采用94不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压再生率

细菌为3-10%真菌在20-80%

融合重组子的筛选通过两亲株遗传标记的互补而得以识别两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是95重组子的检出方法有两种：

直接法

将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子

间接法

把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。重组子的检出方法有两种：直接法将融合液涂布在不补充亲株生96青岛科技大学环境微生物4第四章--微生物的遗传与变异课件974.4人工构建新菌株基因工程概念：在基因水平上的遗传工程，供体DNA切割后，与载体连接，导入某一受体细胞中，获得新品种。

体外切割导入遗传物质基因片段受体细胞4.4人工构建新菌株基因工程98获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定应用基因工程的基本操作获得目的基因基因工程的基本操作99在特殊培养基上（如含有青霉素）筛选目的细菌质粒载体（具有抗性基因）如抵抗青霉素长出必然是重组成功的细菌外源基因片段详见《生物化学》有关章节在特殊培养基上（如含有青霉素）筛选目的细菌质粒载体（具有抗性100对特殊基因进行“剪切－粘贴－链接”制造“超级细菌”++对特殊基因进行“剪切－粘贴－链接”制造“超级细菌”++101Ⅰ.降解石油的工程细菌查氏将能降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作受体细菌，分别将能降解芳烃(质粒B)、芳烃(质粒C)和多环芳烃(质粒D)的质粒，用遗传工程方法人工转入受体细菌，获得多质粒“超级细菌”，可除去原油中2／3的烃。浮油在一般条件下降解需一年以上时间，用“超级细菌”只需几小时即可把浮油去除，速度快效率高。基因工程的应用Ⅰ.降解石油的工程细菌基因工程的应用102Ⅱ.耐汞工程菌恶臭假单胞菌一般在超过2ug／ml汞浓度中即将中毒死，查克拉巴蒂用质粒转移技术，把嗜油假单胞菌的耐汞质粒(MER质粒)转移到恶臭假单胞菌中去，后者获得MER质粒，可在50~70ug／ml氯化汞中生长。Ⅲ．脱色工程菌的构建将分别含有降解偶氮染料质粒的偏号Kx和Kd两株假单胞菌通过质粒转移技术培育出兼有分解两种偶氮染料功能的脱色工程菌。Ⅱ.耐汞工程菌1034.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮-衰退（degeneration）：在微生物的生长过程中，由于变异的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。4.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮104复壮(rejuvenation)：狭义从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义是指在菌种未衰退前就有意识进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。复壮(rejuvenation)：狭义从衰退的群体中找出未衰1054.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变纯菌种不纯菌种突变个体原始个体衰退菌种4.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮菌种衰退的原因1064.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮防止衰退的措施减少传代次数；创造良好的培养条件；利用单核体传代经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；采用有效的菌种保藏方法；4.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮1074.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮菌种的复壮纯种分离

通过寄主体进行复壮

淘汰已衰退的个体

4.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退与复壮1084.5菌种的衰退、复壮和保藏菌种保藏目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换