哺乳动物RNA提取课件

脯乳动物RNA提取AAAAAAtRNAmRNArRNARNase不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-1μg人白细胞105中丰度酵母1050.5-1.5μg拟南芥叶片1mg0.2-0.5μg低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1μg玉米叶片1mgAAAAAA关于RNA的分布

总RNA

真核细胞的RNA主要分为：

1、mRNA:1-5%

起始密码：AUG终止密码：UAA,UAG,UGA。

5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。

1）免受核酸酶破坏，

2）起始、促进蛋白质合成。

3`poly(A)尾巴结构20--200个A.翻译所必需。

2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%

大亚基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt

小亚基40S:18S=1874nt原理1RNase抑制

因RNA分子较小，不易被机械张力拉断，但极易被RNase降解，故而在提取过程中对RNase的抑制尤为重要。故过程中必须添加RNase抑制剂。如DEPC，异硫氰酸胍等。(RNase:核糖核酸酶)ABC破碎组织提取纯化

鉴定分析破碎组织使用高浓度变性剂TRIZOL，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶得到RNA,DNA,蛋白质，细胞碎片提取纯化苯酚氯仿异丙醇乙醇DNA，蛋白质沉淀到有机相RNA留在水相释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离提取核酸沉淀RNA洗涤RNA1.电泳：溶液中带点颗粒在电场中朝着与其自身所带电荷相反的方向移动的现象。利用各RNA分子（带负电荷）在电场中移动速率的差异对其进行鉴定。其速率与带电量成正比，与分子大小成反比。2.核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(－C＝C一C＝C一)，能够强烈吸收250~280nm波长的紫外光。核酸的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。OD260=1,RNA=40μg／mlOD260／OD280小于1.75有蛋白质或酚污染大于2.0有DNA污染（一）准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上。因此，在进行与RNA有关的实验时，必须戴手套。RNase的另一污染源是取液器，一般情况下用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部即可。料制品的处理：尽可能使用无菌、一次性的塑料制品玻璃和金属物品的处理：250°C烘烤3小时以上（二）试剂准备

1．TRIzol试剂2．氯仿3．异丙醇4．75%乙醇（0.1%DEPC配制）5．无RNase的水或0.5℅SDS（0.5%SDS溶液必须用由DEPC预处理、高压灭菌的水）6.取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。研磨后的组织（小米粒大小）（三）操作步骤1.细胞悬液，离心收集细胞，每5~10×10⁶动物细胞要加入1mlTRIzol，反复吸打。加入TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。2.将匀浆样品在室温（15~30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3.加入0.2ml氯仿，轻微振荡15秒（避免蛋白质和DNA脱离导致DNA释放到水相中），室温静置3分钟。4.于2~8℃，12000r/min离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。5.把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。加入0.5ml(1mlTRIzol)异丙醇，室温静置10分钟。6.于2~8℃，12000r/min离心10分钟。离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，去上清。琼脂糖电泳检测凝胶的制备：用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。样品的制备与加样：在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl1×TAE电泳缓冲液及1μl的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。电泳，染色及观察：打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。核酸浓度仪检测取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入1.0mLRNA样液，然后向甲管加入1.0mL蒸馏水，向乙管加入1.0ml过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min，使沉淀完全。3000r/min离心10min，各吸取上清液0.5mL转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL。以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A260和A280的值。A电泳时ladder扭曲BRNA带缺失结果分析电泳时电压过高电压过高，电泳时间长，RNA跑出凝胶电泳时间短，分子大小相近的DNA段不易分辨（电泳）DRNA带模糊ERNA带弱或无C不规则RNA带迁移电泳条件不合适RNA变性RNA变性或降解上样量过多蛋白质污染缓冲液陈旧上样量不足RNA降解应用（mRNA）ART-PCR,Northern杂交，cDNA文库构建B

mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应，体外转录RNA标记，RNA酶保护试验，RNA微注射(RNAMicroinjection)A样品量是否越多越好？问题讨论A样品量是否越多越好？问题讨论答：不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会影响RNA得率如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相应按比例增加。处理样品量RNA得率实际得率预期得率最大量A如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解？问题讨论答：研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染；匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保RNA不被降解。C如何保存提取出的RNA？问题讨论C如何保存提取出的RNA？问题讨论答：①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;②长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。DcDNA文库的构建的基本步骤是什么？问题讨论DcDNA文库的构建的基本步骤是什么？问题讨论答：