第八章微生物遗传变异与菌种保藏(增加内容)课件

第八章微生物遗传变异

与菌种保藏(增加内容)第八章微生物遗传变异

与菌种保藏(增加内容)1本章内容：第一节遗传的物质基础第二节基因突变及修复第三节基因重组第四节微生物诱变育种第四节菌种的衰退、复壮及保藏

本章内容：2第一节基因突变与诱变育种一、基因突变二、突变与育种三、营养缺陷型的筛选第一节基因突变与诱变育种一、基因突变3一基因突变（一）突变类型（二）突变的特点（三）基因突变自发性及不对应性证明（四）基因突变的机制（五）DNA的损伤及修复

一基因突变（一）突变类型4（一）突变类型

细胞形态1、形态突变型

菌落形态

营养缺陷型2、生化突变型抗性突变型抗原性突变（包括细胞内部、表面成分的改变）（一）突变类型细胞形态53、致死性突变型

（合成关键性酶的基因发生了突变，则表现出致死突变）条件致死突变型——如突变为温度敏感型突变（37℃死，25℃活）4、其它突变型毒力突变、糖发酵突变、产量、产品突变等。3、致死性突变型6（二）突变的特点1非对应性：环境与变异无对应性。2自发性：非人为的诱变因素下发生。3规律性：某一特定性的突变率具规律性。4独立性：一个基因的突变对其它基因突变无影响。5稀有性：生物自发突变率为10-6～10-12。6诱变性：诱变剂可提高突变率10~105X。7稳定性：突变性状稳定、可遗传。8可逆性：有回复突变。（二）突变的特点1非对应性：环境与变异无对应性。7（三）基因突变自发性及不对应性的证明

（自学）

自发突变：没有人工诱变因素的参与，生物体自然突变。

1、彷徨试验：2、涂布试验：3、平板影印(Replicaplating)培养试验：（三）基因突变自发性及不对应性的证明

（自学）8彷徨试验彷徨试验9（1）抗性细胞的出现，是在接触噬菌体之前

（2）喷上噬菌体，仅起淘汰野生型和鉴别抗性株作用；

（3）于甲方高度彷徨，说明突变是随机的。（1）抗性细胞的出现，是在接触噬菌体之前10平板影印培养试验涂布敏感菌5×104个共12个平板5×104个菌落5000个细菌/菌落喷入T1保温重新涂布后喷入T1保温6个平板共353个菌落

6个平板共28个菌落平板影印培养试验涂布敏感菌5×104个5×104个菌落喷入T11（1）突变与噬菌体无关；（2）涂布使抗性菌株均匀分布；（3）抗性突变可在任何时间发生，与噬菌体存在无关。以上实验用统计学原理间接证明。（1）突变与噬菌体无关；12影印培养无药培养基含药培养基影印培养试验

原始敏感菌种影印培养无药含药影印培养试验原始敏13（1）实验表明：从未接触str的菌株可发生抗性突变，分离可得到纯的str菌株。（2）由此表明：突变是自发的与环境不对应的。（1）实验表明：从未接触str的菌株可发生抗性突变，分离14（四）基因突变的机制（自学）1DNA的复制（核苷酸对掺入错误）微生物自身产生诱变物质

（咖啡碱、硫氢化合物、重氮丝氨酸等）环境对微生物的诱变作用（辐射、加热等）（四）基因突变的机制（自学）1DNA的复制（核苷酸对掺入15（五）DNA损伤及修复（自学）1光复活作用2切除修复3重组修复4SOS修复（五）DNA损伤及修复（自学）1光复活作用16二突变与育种（一）自发突变与生产育种（二）诱变育种二突变与育种（一）自发突变与生产育种17（一）自发突变与生产育种1.生产选育：群体培养中个别的变异个体表现出生长优势，发现突变种后，随时分离、纯化。

2.定向培育：用特定的环境长期处理某一微生物群体,同时不断对其移种、传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的一种育种方法。（一）自发突变与生产育种1.生产选育：群体培养中个别的变异个18（1）自发突变(spontaneous)：

在非人为的情况下由于遗传物质的微小变化引起的性状变异。（2）原因可能是：

1）环境因素；2）自身有毒产物的积累；3）互变异构效应；3、自发突变的机制（1）自发突变(spontaneous)：3、自发突变的机制19二诱变育种1、概念2、诱变剂3.诱变程序4、诱变的主要环节二诱变育种201、概念

诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。1、概念21（1）概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。

（2）种类：1）物理因子（phisicalagents)

物理诱变剂：U.V、χ、γ、快中子、超声波等。2）化学因子(chemicalagents)3）转座子(transposableelements)2、诱变剂（1）概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。2、诱变剂22

烷化剂(alkylatingagents)：

如：氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍、NTG等

机制：将烷烃加在含氮碱基上，改变氢键性质。化学诱变剂：碱基类似物

(baseanalogs)：

如：叠氮胸腺嘧啶（AIT）等；

机制：在DNA复制时将碱基类似物插入DNA中，而碱基类似物没有正常碱基的氢键性质，在DNA复制时出现突变体。烷化剂(alkylatingagents)：化学诱变23插入剂

(intercalatingagents):

如：溴化乙啶等一些三环分子。机制：与DNA中的一对碱基有大致相同的位点，这些分子不改变碱基的氢键性质，而插入在双螺旋中，加宽间距，引起碱基增加。t插入剂(intercalatingagents):243.诱变程序：

原始菌种原菌种特性鉴定纯化斜面/肉汤培养单孢子/单细胞悬液诱变剂处理计算存活率平板分离观察形态变异，挑单菌落移至斜面初筛复筛小试良种保藏中试3.诱变程序：原始菌种原菌种特性鉴定纯化254诱变的主要环节（1）诱变剂的选择（2）出发菌株的选择（3）单孢子或单细胞悬液的制备（4）设计和采用效率高的筛选方案和方法

4诱变的主要环节（1）诱变剂的选择26（1）诱变剂的选择：

1）了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法。2）处理方式

A、单一因子处理：先后使用

B、复合因子处理：两种以上因素同时使用单一因子重复使用。3）处理剂量：测致死率。方法：平板菌落计数法、纸片法一般杀菌率为70%左右。

（1）诱变剂的选择：27（2）出发菌株：

育种的原始菌种应具备：1）对诱变剂的敏感性高；2）生产中选育过的自发变异菌株；3）本身具有一些有利性状；4）对代谢产物有一定积累；5）已经发生过某些变异。（2）出发菌株：28（3）单孢子或单细胞悬液的制备

1）必要性：单细胞可均匀地接触诱变剂，避免出现不纯的菌落——菌种退化。2）制备：物理诱变剂——生理盐水（0.85%NaCl)

化学诱变剂——缓冲液。3）方法：三角瓶内加φ0.5cm玻璃珠打散10-15min;加０.3%吐温80（表面活性剂），用无菌脱脂棉过滤。4）浓度：细菌、放线菌108个/ml

霉菌、酵母菌106个/ml

（3）单孢子或单细胞悬液的制备29（4）设计和采用效率高的筛选方案和方法

1）初筛：平板上做定性、半定量的测定，观察突变株的生理效应范围。方法梯度平板法（抗性菌株）纸片法（抗性菌株）透明圈法（淀粉酶产生菌株等）变色圈法（氨基酸生产菌株）2）复筛：（见P250）

较精确的生物化学分析方法—做摇瓶测定（4）设计和采用效率高的筛选方案和方法30三、营养缺陷型的筛选（一）概念（二）筛选方法

三、营养缺陷型的筛选（一）概念31（一）概念1.三种遗传型个体2、筛选用的培养基（一）概念1.三种遗传型个体321.三种遗传型个体（1）营养缺陷型（auxotroph）：

经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys-;bio-;（2）野生型(wildtype)：

自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。如：lys+;bio+;

（3）原养型(prototroph)：

指auxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。

1.三种遗传型个体（1）营养缺陷型（auxotroph）：332、筛选用的培养基1）基本培养基（minimalmedium,MM）[-]：

满足野生型菌株营养要求最低成分的组合。

2）完全培养基（completemedium,CM）[+]：

满足一切auxo生长的天然或半组合培养基。3）补充培养基（supplementedmedium,SM）[x]：

在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应auxo生长的组合培养基。2、筛选用的培养基1）基本培养基（minimalmediu34（二）筛选方法1、诱变处理2、

auxo的浓缩3、auxo的检出4、auxo的鉴定5、auxo的应用

（二）筛选方法1、诱变处理351.诱变处理（同前)auxo的筛选程序：细菌培养离心洗涤诱变处理

CM后培养洗涤

MM加PN

涂布于CM平板影印培养挑取鉴定菌种保存。1.诱变处理（同前)auxo的筛选程序：362.auxo的浓缩：（1）抗生素法：

1）原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。2）方法：菌培养在含抗生素的MM基中。（2）菌丝过滤法：1）适用于丝状（放线菌、霉菌）2）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。（3）差别杀菌法：基本培养基上只有野生型生长，加热杀死野生型营养体，保留auxo芽孢。细菌—80℃酵母——60℃适用于产芽孢、孢子菌。2.auxo的浓缩：（1）抗生素法：373.auxo的检出（1）逐个检出法（2）影印平板培养法（3）限量补充法（在mm中加0.01%蛋白胨，

auxo菌落小，野生型大）（4）夹层培养法3.auxo的检出（1）逐个检出法384.auxo的鉴定（1）生长谱法

1）方法简便；2）回变和污染不影响结果3）测定物质可为粉末或纸片（2）混合氨基酸（Vit）法混合氨基酸法步骤：1）将多种营养因子编组，如：2）将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养3）结果分析4）营养因子分组编排时注意：

A、每组内无重复的营养因子

B、每组中应包含只出现一次的因子

C、每组中其他因子应分别出现二次一组：12345二组：26789三组：37101112四组：48111314五组：591214154.auxo的鉴定（1）生长谱法一组：123395.auxo的应用（1）作为标记菌株：进行基因工程、诱变育种、代谢过程的研究中的亲本标记；（2）作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；（3）作为aa、维生素、碱基的测定菌株。5.auxo的应用（1）作为标记菌株：40第二节基因重组一、原核生物的基因重组二、真核生物的基因重组第二节基因重组一、原核生物的基因重组41基因重组把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经遗传物质重新组合后，形成新遗传型个体的方式。

基因重组——分子水平的杂交

一般杂交——细胞水平如：

甲

乙生长快、产量低生长慢、产量高

基因重组

生长快、产量高基因重组如：42一、原核生物的基因重组（一）转化（transformation)（二）转导(transduction)（三）接合(conjugation)（四）原生质体融合（protoplastfusion）一、原核生物的基因重组（一）转化（transformatio43（一）转化（transformation)概念——

受体细胞(receptor)直接吸收了来自供体细胞(donor)的DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。

1.感受态2.感受态因子3.转化因子4.转化的检出（一）转化（transformation)概念——1.感受44（1）感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。（2）转化的决定因素：不同菌株的亲缘关系;受体细胞是否处于感受态；不同菌出现感受态的时间不同。1.感受态一种胞外蛋白质，分子量为5～10kD其作用为：（1）催化转化，促进外来DNA片段吸收。（2）可降解细胞表面某种成分，使DNA受体暴露。1）不同菌细胞DNA受体位点不同。2）有的菌感受态因子只对同种菌起作用。2.感受态因子（1）感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并453.转化因子（1）转化因子由供体提供（2）一般为线状或闭合环状；单链或双链；双链ＤＮＡ有转化能力，单链没有。（3）自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生；实验室里通过提取获得。（4）转化的频率往往很低，一般为0.1～1%。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转化频率最高。游离的ＤＡＮ片断叫转化因子3.转化因子（1）转化因子由供体提供游离的ＤＡＮ片断叫转化464.转化的检出甲-受体strr，lys-

在含str的MM上培养乙-供体strs，lys+

如出现strr，lys+的菌株，则表明已经转化。4.转化的检出甲-受体strr，lys-47第八章微生物遗传变异

与菌种保藏(增加内容)第八章微生物遗传变异

与菌种保藏(增加内容)48本章内容：第一节遗传的物质基础第二节基因突变及修复第三节基因重组第四节微生物诱变育种第四节菌种的衰退、复壮及保藏

本章内容：49第一节基因突变与诱变育种一、基因突变二、突变与育种三、营养缺陷型的筛选第一节基因突变与诱变育种一、基因突变50一基因突变（一）突变类型（二）突变的特点（三）基因突变自发性及不对应性证明（四）基因突变的机制（五）DNA的损伤及修复

一基因突变（一）突变类型51（一）突变类型

细胞形态1、形态突变型

菌落形态

营养缺陷型2、生化突变型抗性突变型抗原性突变（包括细胞内部、表面成分的改变）（一）突变类型细胞形态523、致死性突变型

（合成关键性酶的基因发生了突变，则表现出致死突变）条件致死突变型——如突变为温度敏感型突变（37℃死，25℃活）4、其它突变型毒力突变、糖发酵突变、产量、产品突变等。3、致死性突变型53（二）突变的特点1非对应性：环境与变异无对应性。2自发性：非人为的诱变因素下发生。3规律性：某一特定性的突变率具规律性。4独立性：一个基因的突变对其它基因突变无影响。5稀有性：生物自发突变率为10-6～10-12。6诱变性：诱变剂可提高突变率10~105X。7稳定性：突变性状稳定、可遗传。8可逆性：有回复突变。（二）突变的特点1非对应性：环境与变异无对应性。54（三）基因突变自发性及不对应性的证明

（自学）

自发突变：没有人工诱变因素的参与，生物体自然突变。

1、彷徨试验：2、涂布试验：3、平板影印(Replicaplating)培养试验：（三）基因突变自发性及不对应性的证明

（自学）55彷徨试验彷徨试验56（1）抗性细胞的出现，是在接触噬菌体之前

（2）喷上噬菌体，仅起淘汰野生型和鉴别抗性株作用；

（3）于甲方高度彷徨，说明突变是随机的。（1）抗性细胞的出现，是在接触噬菌体之前57平板影印培养试验涂布敏感菌5×104个共12个平板5×104个菌落5000个细菌/菌落喷入T1保温重新涂布后喷入T1保温6个平板共353个菌落

6个平板共28个菌落平板影印培养试验涂布敏感菌5×104个5×104个菌落喷入T58（1）突变与噬菌体无关；（2）涂布使抗性菌株均匀分布；（3）抗性突变可在任何时间发生，与噬菌体存在无关。以上实验用统计学原理间接证明。（1）突变与噬菌体无关；59影印培养无药培养基含药培养基影印培养试验

原始敏感菌种影印培养无药含药影印培养试验原始敏60（1）实验表明：从未接触str的菌株可发生抗性突变，分离可得到纯的str菌株。（2）由此表明：突变是自发的与环境不对应的。（1）实验表明：从未接触str的菌株可发生抗性突变，分离61（四）基因突变的机制（自学）1DNA的复制（核苷酸对掺入错误）微生物自身产生诱变物质

（咖啡碱、硫氢化合物、重氮丝氨酸等）环境对微生物的诱变作用（辐射、加热等）（四）基因突变的机制（自学）1DNA的复制（核苷酸对掺入62（五）DNA损伤及修复（自学）1光复活作用2切除修复3重组修复4SOS修复（五）DNA损伤及修复（自学）1光复活作用63二突变与育种（一）自发突变与生产育种（二）诱变育种二突变与育种（一）自发突变与生产育种64（一）自发突变与生产育种1.生产选育：群体培养中个别的变异个体表现出生长优势，发现突变种后，随时分离、纯化。

2.定向培育：用特定的环境长期处理某一微生物群体,同时不断对其移种、传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的一种育种方法。（一）自发突变与生产育种1.生产选育：群体培养中个别的变异个65（1）自发突变(spontaneous)：

在非人为的情况下由于遗传物质的微小变化引起的性状变异。（2）原因可能是：

1）环境因素；2）自身有毒产物的积累；3）互变异构效应；3、自发突变的机制（1）自发突变(spontaneous)：3、自发突变的机制66二诱变育种1、概念2、诱变剂3.诱变程序4、诱变的主要环节二诱变育种671、概念

诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。1、概念68（1）概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。

（2）种类：1）物理因子（phisicalagents)

物理诱变剂：U.V、χ、γ、快中子、超声波等。2）化学因子(chemicalagents)3）转座子(transposableelements)2、诱变剂（1）概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。2、诱变剂69

烷化剂(alkylatingagents)：

如：氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍、NTG等

机制：将烷烃加在含氮碱基上，改变氢键性质。化学诱变剂：碱基类似物

(baseanalogs)：

如：叠氮胸腺嘧啶（AIT）等；

机制：在DNA复制时将碱基类似物插入DNA中，而碱基类似物没有正常碱基的氢键性质，在DNA复制时出现突变体。烷化剂(alkylatingagents)：化学诱变70插入剂

(intercalatingagents):

如：溴化乙啶等一些三环分子。机制：与DNA中的一对碱基有大致相同的位点，这些分子不改变碱基的氢键性质，而插入在双螺旋中，加宽间距，引起碱基增加。t插入剂(intercalatingagents):713.诱变程序：

原始菌种原菌种特性鉴定纯化斜面/肉汤培养单孢子/单细胞悬液诱变剂处理计算存活率平板分离观察形态变异，挑单菌落移至斜面初筛复筛小试良种保藏中试3.诱变程序：原始菌种原菌种特性鉴定纯化724诱变的主要环节（1）诱变剂的选择（2）出发菌株的选择（3）单孢子或单细胞悬液的制备（4）设计和采用效率高的筛选方案和方法

4诱变的主要环节（1）诱变剂的选择73（1）诱变剂的选择：

1）了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法。2）处理方式

A、单一因子处理：先后使用

B、复合因子处理：两种以上因素同时使用单一因子重复使用。3）处理剂量：测致死率。方法：平板菌落计数法、纸片法一般杀菌率为70%左右。

（1）诱变剂的选择：74（2）出发菌株：

育种的原始菌种应具备：1）对诱变剂的敏感性高；2）生产中选育过的自发变异菌株；3）本身具有一些有利性状；4）对代谢产物有一定积累；5）已经发生过某些变异。（2）出发菌株：75（3）单孢子或单细胞悬液的制备

1）必要性：单细胞可均匀地接触诱变剂，避免出现不纯的菌落——菌种退化。2）制备：物理诱变剂——生理盐水（0.85%NaCl)

化学诱变剂——缓冲液。3）方法：三角瓶内加φ0.5cm玻璃珠打散10-15min;加０.3%吐温80（表面活性剂），用无菌脱脂棉过滤。4）浓度：细菌、放线菌108个/ml

霉菌、酵母菌106个/ml

（3）单孢子或单细胞悬液的制备76（4）设计和采用效率高的筛选方案和方法

1）初筛：平板上做定性、半定量的测定，观察突变株的生理效应范围。方法梯度平板法（抗性菌株）纸片法（抗性菌株）透明圈法（淀粉酶产生菌株等）变色圈法（氨基酸生产菌株）2）复筛：（见P250）

较精确的生物化学分析方法—做摇瓶测定（4）设计和采用效率高的筛选方案和方法77三、营养缺陷型的筛选（一）概念（二）筛选方法

三、营养缺陷型的筛选（一）概念78（一）概念1.三种遗传型个体2、筛选用的培养基（一）概念1.三种遗传型个体791.三种遗传型个体（1）营养缺陷型（auxotroph）：

经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys-;bio-;（2）野生型(wildtype)：

自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。如：lys+;bio+;

（3）原养型(prototroph)：

指auxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。

1.三种遗传型个体（1）营养缺陷型（auxotroph）：802、筛选用的培养基1）基本培养基（minimalmedium,MM）[-]：

满足野生型菌株营养要求最低成分的组合。

2）完全培养基（completemedium,CM）[+]：

满足一切auxo生长的天然或半组合培养基。3）补充培养基（supplementedmedium,SM）[x]：

在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应auxo生长的组合培养基。2、筛选用的培养基1）基本培养基（minimalmediu81（二）筛选方法1、诱变处理2、

auxo的浓缩3、auxo的检出4、auxo的鉴定5、auxo的应用

（二）筛选方法1、诱变处理821.诱变处理（同前)auxo的筛选程序：细菌培养离心洗涤诱变处理

CM后培养洗涤

MM加PN

涂布于CM平板影印培养挑取鉴定菌种保存。1.诱变处理（同前)auxo的筛选程序：832.auxo的浓缩：（1）抗生素法：

1）原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。2）方法：菌培养在含抗生素的MM基中。（2）菌丝过滤法：1）适用于丝状（放线菌、霉菌）2）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。（3）差别杀菌法：基本培养基上只有野生型生长，加热杀死野生型营养体，保留auxo芽孢。细菌—80℃酵母——60℃适用于产芽孢、孢子菌。2.auxo的浓缩：（1）抗生素法：843.auxo的检出（1）逐个检出法（2）影印平板培养法（3）限量补充法（在mm中加0.01%蛋白胨，

auxo菌落小，野生型大）（4）夹层培养法3.auxo的检出（1）逐个检出法854.auxo的鉴定（1）生长谱法

1）方法简便；2）回变和污染不影响结果3）测定物质可为粉末或纸片（2）混合氨基酸（Vit）法混合氨基酸法步骤：1）将多种营养因子编组，如：2）将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养3）结果分析4）营养因子分组编排时注意：

A、每组内无重复的营养因子

B、每组中应包含只出现一次的因子

C、每组中其他因子应分别出现二次一组：12345二组：26789三组：37101112四组：4811