免疫透射比浊法

..Word文档Word文档免疫透射比浊法一、原理当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。这一方法早于1959SchultreSchuick形成免疫复合物进行定量，若抗体不纯混杂有另一种或两种少量的抗体，这种免疫复合物就不是单一复合物而是大杂烩，结果偏高；②抗原抗体比例适当，因免疫复合物形成有三个阶段，第一阶段是复合物形成抗原抗体复合物；第二阶段是初步形成抗原抗体复合物，此阶段是复合物交联成大的网格状结构；第三阶段是复合物聚合产生絮状沉淀。只有在抗原与抗体等价时即无过剩抗体，此时，复合物的结合与解离处于平衡状态，其混浊程度达高峰。在抗体过量时，随抗原量的增加而复合物形成也增加，其测定只能在反应曲线的左侧进行（18-4）；③一般要求溶液中有非离子性亲水多聚体促进免疫复合物的形成，如聚二6000pH6.5～8.0（amphipathichelix）的特性，对脂质（特别是磷脂）有高度亲和力，与脂质结合后有时会掩盖抗原位点或构象改变，可以部分或完全丧失对抗血清的特异反应。为此，载脂蛋白检测过程中有必要先暴露抗原位点，所用试剂有表面活性剂，尿素，盐酸胍和吐温等解离蛋白剂，或用四甲基脲脱脂或有机溶剂脱脂等暴露抗原决定簇等方法，血清脂蛋白颗粒中的载脂蛋白，能在短时间内形成抗原抗体复合物进行定量；④抗原不能过量，因为抗原过量，抗原抗体复合物形成不但不增加，反而会减少，光散射或光吸收减少，检测结果反而偏低。图18-4抗原抗体反应曲线在免疫比浊过程中，由于抗原抗体结合的三过程，从而导致光密度与浓度之间不呈线性关系，一般是33573ApoAⅠ（B）透射比浊测定法100脂蛋白抗原在溶液中与相应特异抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒，分散于溶液介质中，在一定波长下测定其混浊程度，进行ApoAⅠ（B ）的定量测定。100（一）手工操作1．原理血清ApoAⅠ（B ）+抗人ApoAⅠ（B ）→抗原抗体复合→测定光密度100 100试剂（伊利康）Apo（RⅠ），4%PEG6000羊抗人ApoAⅠ（B ）抗体液（RⅡ）：监用前取抗血清200μl，加0.9%NaCl液700μl，混匀，100待用，置冰箱一周内有效。ApoAⅠ（B ）参考血清（RⅢ）100操作按ApoAⅠ抗血清液或ApoB 抗血清加相应的Apo缓冲液0.9ml的比例混合成单一试剂100（Apo抗体液）。最好临用前配制当天用量。各试剂用量如下表Ⅰ

ApoB

100参考血清待测血清标准管5μl测定管5μl空白管标准管5μl测定管5μl空白管ApoAⅠ抗体液ApoB 抗体液1001.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml10min340min，于半自动分析仪上先吸入空白管液，再吸入标准管，仪器根据光密度及参考值得出一换算系数，再吸入测定管，仪器内根据光密度及系数进行运算，打印结果。定标方法，根据免疫比浊法原理，应取多点39），x2x33①校正工作曲线的绘制：配制抗血清稀释工作液：按RⅠ0.9ml，加RⅡ100μl的比例（Apo抗体液）混匀，待用。5RⅢ（参考血清），0.955浓度，其他4管分别为第5管的1/2、1/4、1/8、1/16（或浓度为0即0.9%NaCl）。表18-20标准曲线制备的各管（点）浓度管号123451号管（0）（μl）2号管（1/8）（μl）553（1/4）（μl）4（1/2）（μl）5（1/1）（μl）555Apo抗体液（ml）1.01.01.01.01.0混匀各管，置37℃水浴保温10min，按程序上机作工作曲线。②标本测定：吸待测血清（测定管）5μl，加上述稀释抗血清工作液1.0ml，于37℃水浴保温10min，..Word文档Word文档上机读数，打印结果。③如测定值超过工作曲线上限值，仪器会打印显示“过高”，此时，将待测标本稀释1倍再测。④每批号的抗血清应作一次多点定标，即测定标本的抗血清应与定标的抗血清是同一批号抗血清。（二）生化分析仪测定1．原理脂蛋白抗原在溶液中与相应特异抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒分散于溶液介质中，在一定波长下测定其混浊程度，进行ApoAⅠ（B ）的定量测定。100ApoAⅠ（B ）+抗人ApoAⅠ（B ）→抗原抗体复合物→测定吸光光密度100 1002．双试剂单（双）波长法试剂（温州伊利康）RⅠ：Apo缓冲液，含4%PEG6000和表面活性。RⅡ：羊抗人ApoA（B ）稀释抗血清100RⅢ：Apo定值血清各试剂及标本用量如下表：项目 血

Apo

ApoAⅠ抗血清液

100

抗血清液（RⅠ）

（RⅡ）

（RⅡ）AⅠApoB100

2～5μl2～5μl

300～350μl300～350μl

80～100μl

80-100μl5Apo18-2118-55AⅠ（0）上机（终点法或两点法）说明：①Apo340～700nm340nmApo(5)计算△A=A2-A1,以△A值采用免疫定标自动运算。3.单一试剂单波长法试剂同双试剂法标本及试剂用量AⅠ抗血清液或BⅡ0oⅠ的比例混合成单一试剂(Apo2～8℃保存一周有效。定标：按五点梯度稀释定值血清（18-21），以终点法或两点法进行免疫定标。按以下步骤操作：以△A=A2-A12～8℃冰箱保存，只允许使用一周；④血清标本无需再处理。ApoAⅠ、AⅡ、B、CCE的全自动生化分析仪检测的有关数据。上机参数（CL-7200）18-2118-21自动生化分析仪检测Apo反应类型样品量AⅠ终点法3μlAⅡ3μlB3μlCⅡ8μlCⅢ3μlE5μl测量波长600nm（第一）700nm（第二）数据数据数据数据700nm340nm700nm340nm700nm340nm反应时间第一波长5min第二波长4.99min数据数据数据数据数据数据数据数据数据数据..Word文档Word文档试剂Ⅰ350μl290μl350μl300μl290μl350μl试剂Ⅱ100μl75μl100μl50μl75μl50μl单位g/Lg/Lg/Lmg/dlmg/dlmg/dl标准浓度点数55555518-22表18-22生化分析仪检测Apo的定标浓度标准管号123456稀释倍数01：21：41：81：160ApoAⅠ度数(g/L)172864321.510.80ApoAⅡ度数(g/L)361894.52.250ApoB浓度(g/L)1809145.522.611.30ApoCⅡ浓度(mg/dl)4210.50.250ApoCⅢ浓度(mg/dl)52.51.250.630.310ApoE浓度(mg/dl)1052.51.250.6250单一试剂和双试剂检测方法的比较单一试剂和双试剂在全自动生化分析仪测定的光密度变化过程，如图18-6所示。从理论上考虑任何一种生化测定方法的试剂，临用时混合最好，可以消除试剂各种成份的自身化学变化和相互影响。而在实际工作中，是不可能的，只能是将几种不会起化学反应而又无相互影响的试剂配制2～412即单一试剂和双试剂两种形式。笔者认为双试剂比单一试剂好，尤其是含酶试剂和免疫试剂以双试剂包装形式为好，有利于对酶的活性或抗体效价的保存。单一试剂是所有试剂混合在一起，存放过程中，有可能因化学物质的存在而损害试剂中的工具酶或抗体，存放时间越长，损害可能性越大，然而双试剂不存在这一问题。R1（R2）后，使其抗体适应抗原决定簇的测定法，既能自动扣去空白，又能使化学反应快速进行，从而迅速地完成检测的全过程。图18-6单双试剂法反应过程的光密度变化曲线图A：双试管法；B：为单一试剂法（贺小玲胡汉宁）参考文献生出版社，1995：362FagerG.WiklundO.etal.Serumapolipoproteinlivelsinrealtiontoacutemyocardicalinfarctionanditsriskfactors.Atherosclerosis,1984,36:6774MaviejkoJ,HolmesR,KottkeBA,etal.ApolipoproteinAIasamarkerofangiographicallyassessedartery,NEnglJMed,1983,309:385-389VanderGL,BarbankJ,SasseEA,CorrelateionoftheextentofanewenzymeimmunoassaytechiqueforApoB.Atherosclerosis,1984,50:29-33CampeauL,EryallbertM,LesperanceJ,etal.Therelationofriskfactorstothedevelopmentofatheroscierosisinsaphenousveinbypassgrattsandproressionofdiseaseinthenativepopulation.NEnglJMed,1984,3111:1329-1332KorenE,PuchoisP,Alaupovic,etalQuantificationoftwodifferenttypeofapolipoproteinAIcontaininglipoproteinaprticesinplasmabyenzymelindeddifferentealantibodyimmunosorbentassay,ClinChem,1987,33:38-41王抒，李健斋，赵淑华等，血清载脂蛋白参考值.中华医学检验杂志，1996，19：343～348李健斋.血清载脂蛋白免疫测定及其标准化问题.中华医学检验杂志，1992，15：58-709．MarvovinaSM,AlbereJJ,DatiF,etalInternationalfederationofclinicalchemistrystandardizationprojectformeanurementsof