基因表达的检测

关于基因表达的检测第一页，共七十五页，2022年，8月28日一、基因表达的概述：从基因到蛋白质――中心法则：

DNAmRNA蛋白质转录逆转录翻译复制2.教学目的：了解检测基因表达主要方法的原理及大概操作要点理解各检测方法的优缺点懂得合理选择实验方法及对各实验结果的合理解释第二页，共七十五页，2022年，8月28日二、基因表达调控的基本概念与原理：基因表达调控的概念及方式：基因：一个遗传单位，是一段可表达的DNA序列。基因组：一个单倍体细胞或病毒颗粒的全套基因。人类基因组含约4万个基因。基因表达：基因所包含的遗传信息通过转录生成RNA，再经过翻译生成蛋白质的过程。一般而言，在某一特定时刻，高等生物仅有不到15%的基因表达。基因表达调控：基因表达有其特定的规律，并受到机体各种因素的调节和控制。对基因的表达实施精确的控制，使细胞适应不同阶段、不同环境条件下的生长与发育的需要，维持机体正常生命活动，有着重要意义。可诱导基因：基因表达的时间特异性基因表达的空间特异性（组织特异性）看家基因:第三页，共七十五页，2022年，8月28日2.基因表达调控的基本原理：原核生物和真核生物的基因表达调控尽管在细节上差异很大，但两者的调控模式和原理极为相似。调节作用主要包括核酸之间的相互作用、核酸与蛋白质之间的相互作用以及蛋白质之间的相互作用。调控作用可能是正向的或负向的。调控点可以位于基因表达过程的各个环节，如基因的激活、转录起始、转录后加工、mRNA降解、蛋白质翻译、翻译后加工和蛋白质降解等。特异DNA序列对基因表达的影响：真（原）核生物DNA分子上的特定序列构成了基因表达的基本信号：起始密码、调控序列、编码序列、终止密码、单拷贝序列、重复序列等。第四页，共七十五页，2022年，8月28日DNA与蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：DNA上的特定序列可以与相应的蛋白质结合，这些蛋白质依其作用分为：阻遏蛋白（repressor）：与操纵序列结合，阻遏基因的转录。激活蛋白（activator）：与启动子中的特定序列结合，增强转录。特异因子转录因子（transcriptionfactor,TF）也称反式作用因子（trans-actingfactor）：通过与顺式作用元件结合，调节转录活性DNA-蛋白质之间的结合通常是非共价键的形式，通过蛋白质分子中特殊的结构域与DNA分子中双螺旋结构的大沟结合，调节基因的转录。常见的DNA-蛋白质结合域有：螺旋－转角－螺旋（helix-turn-helix）锌指（zincfingers）第五页，共七十五页，2022年，8月28日蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：调节蛋白通常通过二聚体（dimer）或多聚体（polymer）的形式与DNA结合不同的调节蛋白也可以相互作用或结合后，再与DNA特定部位结合，调节同一基因的不同转录水平，尤其多见于真核生物。蛋白质之间相互作用的典型特征包括：亮氨酸拉链（leucinezipper）螺旋－转角－螺旋（helix-loop-helix）RNA聚合酶对基因表达的影响：转录起始是通过RNA聚合酶与启动子的结合来实现的，转录起始的调控是基因表达调控中最重要、最基础的调控点之一。不同启动子的序列不同，因而影响它们与RNA聚合酶结合的亲和力，亲和力的不同继而直接影响转录起始的频率。RNA聚合酶和启动子的结合也会受到调节蛋白的影响,阻遏蛋白、激活蛋白、特异因子、转录因子等均可通过增强或者干扰RNA聚合酶与启动子之间的结合，调节基因的起始。第六页，共七十五页，2022年，8月28日三、原核生物的基因表达调控：

原核生物结构简单、无细胞核，转录和翻译过程耦联在一起，对环境条件的变化反应迅速，可以根据环境因素的变化迅速调整自身基因的表达，满足其生长和繁殖的需要。原核基因表达调控的特点为：普遍存在操纵子调控模式通过特异的阻遏蛋白或激活蛋白调节基因的转录转录与翻译的耦联转录水平的调控：乳糖操纵子的调控：第七页，共七十五页，2022年，8月28日阻遏蛋白对乳糖操纵子的调节第八页，共七十五页，2022年，8月28日2）其它转录调控机制：转录衰减：基因重组：翻译水平的调控：SD序列对翻译的影响：SD序列是原核生物mRNA起始密码子AUG上游3-10碱基的由3-9个碱基组成的一个富含嘌呤核苷酸的序列，能与核糖体小亚基16srRNA3’末端富含嘧啶的序列互补，从而使核糖体与mRNA结合，开始翻译。mRNA的稳定性：原核细胞内mRNA通常很快被降解。例如：E.coli的许多mRNA在37℃时的平均寿命只有大约2分钟。翻译产物对翻译的影响：有些mRNA编码的蛋白质，本身就是在蛋白翻译过程中发挥作用的因子。这些因子可对自身的翻译产生调控作用。如起始因子3（IF-3），当它合成过多时，能有效地校正和抑制其自身的起始密码子与起始tRNA的配对而抑制翻译的起始。另外还有核糖体蛋白、翻译终止因子等均可影响翻译过程。第九页，共七十五页，2022年，8月28日四、真核生物的基因表达调控：真核生物基因表达调控与原核不同点在于：转录激活与染色体转录区特定结构相适应正性调节占主导转录与翻译在空间上的分离更多、更复杂的调控蛋白第十页，共七十五页，2022年，8月28日（一）、DNA水平的调控（真核生物表达调控的次要和辅助手段）：染色质（chromatin）结构对基因表达的调控作用： 真核基因通常与组蛋白（histone）结合形成核小体，从而保护DNA免受损伤，维持基因组稳定，抑制基因的表达。影响基因表达水平的主要有：组蛋白的含量组蛋白的结构调节蛋白与组蛋白H1和H5竟争和DNA的结合，从而解除组蛋白对基因表达的抑制作用。基因修饰对基因表达的调控作用： 胞嘧啶经甲基化为5-甲基胞嘧啶（常出现在5’端侧翼序列的GC丰富区），影响DNA特异序列与转录因子的结合，使基因不能转录或阻止转录复合物的形成。第十一页，共七十五页，2022年，8月28日基因丢失：在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除掉某些基因的活性。染色体破碎所致的不均等分配。仅发生在低等生物中（原生动物、线虫、昆虫、甲壳类动物等），此现象在高等生物中迄今尚未发现。基因扩增：细胞内某些特定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象，它是细胞在短期内为满足某种需要（发育需要、外界环境因素）而产生足够的基因产物的一种调控手段。第十二页，共七十五页，2022年，8月28日基因重排：

基因重排是指某些基因片段改变原来的存在顺序，通过调整有关基因片段的衔接顺序，重新组成为一个完整的转录单位。一种熟知的以基因重排来调节不同基因表达的例子是哺乳动物免疫球蛋白各编码区的连接：一个免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链和重链。轻链：可变区、恒定区、连接区都由位于同一染色体不同位置的DNA片段编码，在形成活性基因前，上述各一个基因通过染色体内重组成连到一起。重链：可变区、恒定区、连接区、歧化区第十三页，共七十五页，2022年，8月28日（二）、转录水平的调控：

转录水平的调控是真核基因表达调控中最重要的环节，大多数生物基因在转录水平的调控是决定细胞质中mRNA水平的一个最重要方式，调控主要通过反式作用因子和RNA聚合酶的相互作用来实现。反式作用因子是一类细胞核内存在的蛋白质，是与特异的DNA序列（顺式作用元件）结合的调控蛋白。它通过识别并结合上游启动子元件和增强子中的顺式元件，激活或阻遏基因的表达。它包括三个功能域：DNA识别结合域（常有锌指结构）转录活性域（富含某些特定氨基酸如谷氨酰氨）蛋白质相互作用结构域（常具有亮氨酸拉链结构和螺旋－环－螺旋结构等）。第十四页，共七十五页，2022年，8月28日转录起始复合物:

转录起始复合物的形成过程有三步：TATA因子结合TATA盒（形成TATA因子－DNA复合物）RNApol识别并结合TATA因子－DNA复合物（闭合复合物，DNA双链没有打开，不能启动转录）转录起始因子与RNApol结合，形成转录起始复合物（开放复合物，DNA双螺旋已打开，可以合成RNA）转录起始的调控：

基因表达的转录水平调控主要通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成。调控机制涉及反式作用因子的激活及反式作用因子的作用等。反式作用因子的活性调节：表达调节：迅速合成、迅速降解共价修饰：磷酸化－去磷酸化、糖基化配体结合：激素－激素受体（是核内的反式作用因子）蛋白质与蛋白质相互作用：max蛋白－c-myc蛋白（核内的反式作用因子）第十五页，共七十五页，2022年，8月28日反式作用因子与顺式元件结合的调节：顺式作用元件包括：上游启动子元件远距离的增强子元件（上游增强子元件、下游增强子元件）反式作用因子作用方式的调节： 反式作用因子通过下列不同的方式作用到RNA聚合酶结合位点从而影响其转录活性：成环扭曲滑动连锁反应反式作用因子的组合式调节： 几种不同的反式作用因子组合，发挥特定的作用。第十六页，共七十五页，2022年，8月28日（三）、转录后水平的调控：

转录后水平的调控一般是指基因转录后对转录产物进行一系列修饰、加工过程，主要包括mRNA选择性剪切、胞内定位以及mRNA稳定性调节：

DNA（核内）

转录

mRNA前体

加工成熟mRNA

运输细胞质

第十七页，共七十五页，2022年，8月28日mRNA前体加帽、加尾以调控其稳定性：5’加帽（capping）：7－甲基鸟苷三磷酸3’端加尾（tailing）：多聚A（PolyA）mRNA前体的选择性剪接（splicing）与拼接：选择性剪切：去除mRNA前体中的内含子选择性拼接：从同一基因产生若干种有部分相同结构的蛋白质，即通过Mrnau前性的选择性拼接而产生不同的成熟mRNA，然后翻译成不同的蛋白质。选择性表达：多基因的基因家族中的各成员在特定的细胞中，在一定的发育阶段和在一定的生理条件下选择性的表达。第十八页，共七十五页，2022年，8月28日RNA编辑的调控：

RNA编辑（editing）：是指转录后的mRNA前体在编码区发生核苷酸改变的现象，从而产生出氨基酸序列不同的蛋白质。包括：核苷酸的替换核苷酸的插入或缺失mRNA转运的调控：mRNA前体经过加帽、加尾、剪切等加工后通过核膜孔从核内运至胞浆。大约只有20%的mRNA进入胞浆，留在核内的mRNA约50%会在1小时内降解。第十九页，共七十五页，2022年，8月28日（四）、翻译水平的调控：

翻译水平的调控主要是控制mRNA的稳定性和mRNA翻译的起始频率，是一种迅速控制基因表达的方式，是各种高等生物广泛采用的调控方式。mRNA的稳定性，取决于：mRNA的二级结构（不易受外切酶攻击）帽子及其种类polyA尾的长短与mRNA结合的蛋白质的种类mRNA翻译起始的调控（即控制mRNA的可翻译性）：许多蛋白质因子可以影响蛋白质合成的起始，如真核生物起始因子－2（eukaryoticinitiationfactor，eIF-2）的磷酸化会使其活性降低，从而减少蛋白质合成。Recruitmentfactor可使maskedmRNA与核糖体、氨酰基-tRNA、蛋白质结合。真核生物蛋白质合成的自体调控： 某些蛋白可抑制其自身mRNA的翻译第二十页，共七十五页，2022年，8月28日（五）、翻译后水平的调控： mRNA翻译的产物－－新生多肽链大多是没有生物学活性的，必须经过加工、修饰才能成为有活性的蛋白质，加工、修饰过程包括：信号肽的切除：由15－30个疏水氨基酸组成的信号肽可使蛋白质从内质网膜进入高尔基体。新生肽链的修饰：磷酸化、羟基化、糖基化、乙酰化等。肽链的剪切与正确折叠第二十一页，共七十五页，2022年，8月28日五、蛋白表达水平的检测方法及选择DNA水平的检测：SouthernblotPCRDNA测序蛋白质表达水平的检测：SDS－PAGE与WesternblotELISA流式细胞仪（FACS）检测免疫组化蛋白质芯片mRNA水平的检测：Northernblot基因芯片Nucleirun-on原位杂交RT-PCR实时荧光定量RT－PCR半定量RT－PCR第二十二页，共七十五页，2022年，8月28日SouthernBlot原理：DNA－DNA杂交操作过程：基因组DNA经过一种或多种限制性内切酶消化消化后的DNA片段在标准的琼脂糖凝胶上经电泳按照大小进行分离DNA经原位变性后从凝胶中转移到固定支持物上（通常为尼龙膜或硝酸纤维素膜）变性的DNA可以与标记的DNA、RNA或寡核苷酸探针杂交通过特定的检测方法（如放射自显影）来确定与探针互补的带的位置；或通过对经过不同限制性内切酶（单一或联合使用的）消化过的基因组DNA产生的带的大小及数量的估计来判断结果第二十三页，共七十五页，2022年，8月28日

重物（400克）琼脂糖凝胶滤纸滤纸桥尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板支持物20XSSC上行毛细管转移示意图第二十四页，共七十五页，2022年，8月28日PolymerasedChainReaction(PCR)原理：高温下双链DNA变性为单链DNA低温下单链DNA与引物寡核苷酸复性中温下由DNA聚合酶进行互补链的修复复制过程第二十五页，共七十五页，2022年，8月28日2.方法10X反应缓冲液：Mg2+，K+50-100mmol/L，dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）模板DNA引物（引物是PCR反应成功与否的关键之一）上游引物下游引物TaqDNA聚合酶ddH2O95C1min55C1min72C1min4C35X第二十六页，共七十五页，2022年，8月28日DNA序列测定Sanger双脱氧未端终止法测序原理：

聚合酶扩增：PCR扩增的同时在部分产物末端掺入四色荧光标记的四种ddNTPs电泳分离、激光读序

ABI377全自动测序仪进行DNA核苷酸序列测定方法：

引物准备：纯度：须事先用PAGE胶纯化过浓度：配制成5-10pmol/uL

第二十七页，共七十五页，2022年，8月28日模板准备：纯度：推荐使用试剂盒进行纯化模板量：PCR产物100-200bp2-4ng单链50-100ng

200-500bp4-10ng双链200-500ng

500-1000bp6-20ng粘粒、BAC0.5-1ug

1000-2000bp10-40ng细菌基因组DNA2-3ug

2000bp80-2000ng测序PCR：用于PCR产物，单、双链加样：TerminatorReadyReactionMix8.0ul模板不定量引物3.2pmolddH2O不定量合计20ul反应：96C10sec50C5sec60C4min4C70X第二十八页，共七十五页，2022年，8月28日纯化测序产物：加50ul95%乙醇，混匀置室温（25度）15分钟，12000g离心20分钟，弃上清加150ul75%乙醇洗1-2次，同上离心10分钟。弃上清，抽干。制备测序电泳用PAG变性胶

预电泳（Pre-run）

电泳数据分析

第二十九页，共七十五页，2022年，8月28日SDS－PAGE与Westernblot

(蛋白凝胶电泳及免疫印迹法)原理：确保蛋白质解离为单个多肽亚基（SDS）通过分离胶的筛分作用，将蛋白质多肽按分子量的大小不同得到分离将蛋白质固定于尼龙膜上以抗体识别待检蛋白（抗原）固定物1Ab2AbE

蛋白质（抗原）第三十页，共七十五页，2022年，8月28日2.操作过程样品制备：收集细胞PBS洗涤并离心沉淀细胞加入适量细胞裂解液重悬细胞，置冰上30分钟高速离心，取上清（蛋白溶液）加入等量2XSDS－PAGE样品缓冲液煮沸5分钟后上样（或保存于－20℃）制胶（不连续缓冲胶系统）：胶的成份：压缩胶分离胶第三十一页，共七十五页，2022年，8月28日胶浓度的选择：丙烯酰氨浓度蛋白线性分离范围/KDa1512107.5510－4312－6020－8036－9457－212加样与电泳：加适量的样品（200－1000ug总蛋白量）、对照及蛋白分子量marker180－200volts电泳直到溴酚蓝跑出凝胶（Bio-Rad电泳装置）第三十二页，共七十五页，2022年，8月28日凝胶染色：考马斯亮蓝（R－250）染色银染印迹转移：原理：带正电荷的蛋白质在电场作用下从负极（凝胶）向正极（尼龙膜或硝纤膜）迁移，蛋白质通过疏水作用结合到膜上4℃条件下，300mA电泳1－3小时（Bio-Rad电泳装置）封闭：5%脱脂牛奶或5%BSA，室温下1小时（或4℃过夜）一抗反应：选择合适的第一抗体适量抗体以5%脱脂牛奶或5%BSA稀释室温下1小时（或4℃过夜）反应第三十三页，共七十五页，2022年，8月28日二抗反应：选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体适量抗体以5%脱脂牛奶或5%BSA稀释室温下1小时（或4℃过夜）反应加生色底物显色HRP的底物：生色：4－氯－1－萘酚/H2O2发光：ECL溶液（鲁米诺/4－碘代酚/H2O2）AP的底物：生色：氮蓝四唑/5－溴－4氯吲哚磷酸发光：AMPPD拍片或曝光、洗片第三十四页，共七十五页，2022年，8月28日0hr2hr4hr6hr8hr10hr12hr14hrp53p21-TubulinTimeafterirradiationDNAdamageinducesdown-regulationofhistonegenetranscriptionwhichparallelscellcyclearrest第三十五页，共七十五页，2022年，8月28日优缺点：优点：不须纯化而直接反映其中单个蛋白表达水平的变化用于观察细胞处理后最后一步变化，结果最可靠、真实实验简单可靠、重复性好缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程灵敏度相对较低，多用于检测细胞表达量较大的蛋白质的变化对抗体的依赖度高应用：直接检测蛋白质的有无、变化可直接检测部分蛋白的功能与其它方法结合后，可检测蛋白－蛋白相互作用第三十六页，共七十五页，2022年，8月28日酶联免疫吸附试验（ELISA）原理：将可溶性蛋白质（单一组分或混合组分）固定于酶标板壁上－－抗原或抗体检测待检蛋白－－抗体或抗原固定物1Ab2AbE

蛋白质（抗原）第三十七页，共七十五页，2022年，8月28日2.操作过程（间接法、双抗体夹心法）样品处理：已知样品必须是可溶性蛋白－－溶于PBS、水等样品可以是单一组分或混合组分包板：适量的抗原以高PH溶液（PH7.6－7.8的碳酸盐缓冲液）或低PH溶液（PH4.8枸椽酸盐缓冲液）稀释后包被酶标板4℃反应1－2天PBS洗涤后，即可使用该板或可较长期保存封闭：4%脱脂牛奶或4%BSA，室温下1小时（或4℃过夜）第三十八页，共七十五页，2022年，8月28日一抗反应：选择合适的第一抗体适量抗体以4%脱脂牛奶或4%BSA稀释室温下1小时（或4℃过夜）反应二抗反应：选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体适量抗体以4%脱脂牛奶或4%BSA稀释室温下1小时（或4℃过夜）反应加生色底物显色：HRP的底物：H2O2/TMB终止：2MH2SO4结果判断：目测法仪器法第三十九页，共七十五页，2022年，8月28日优缺点：优点：用于观察细胞处理后最后一步变化，结果可靠、真实方法简单（多样）、快速可大批量检测标本敏感性较高缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程多用于检测细胞表达量较大的可溶性蛋白质的变化特异性相对较低，重复性相对较差对所用抗体的依赖度高应用：大批量、直接检测可溶性蛋白质的有无、变化第四十页，共七十五页，2022年，8月28日WhatisFlowCytometry?FlowCytometryisapowerfultechniqueforcellcounting,sortingandsurfacemarkeranalyzingFlowCytometrycanprovidequantitativeinformationaboutcellsurfacemarkersBasedonimmunofluorescencetechniqueandcomputer-aidedanalysis流式细胞仪（FACS）检测第四十一页，共七十五页，2022年，8月28日原理：基于单个细胞水平的检测第四十二页，共七十五页，2022年，8月28日Fluorescence-activatedcellsorter(FACS)FACSisoneversionofFlowCytometry,whichcansortcellsbytheirsurfacemarkersIndividualcellispositivelyornegativelychargedbasedontheirfluorescencecolorWhenchargedcellspassthroughanelectricfield,theyaredeflectedandhenceseparated第四十三页，共七十五页，2022年，8月28日2.FASC的应用：细胞表面标志细胞组分：DNA含量RNA含量蛋白质含量细胞动力学参数细胞增殖细胞凋亡细胞分化其它：白血病免疫分型造血干细胞血小板机体免疫功能各种基因癌基因和抑癌基因调节基因肿瘤转移相关基因多药耐药基因第四十四页，共七十五页，2022年，8月28日UseFlowCytometrytoexamineCD4andCD8expressionduring

TcellmaturationTreatTcellpopulationwithanti-CD4monoclonalantibody(coupledwithdye1)andanti-CD8monoclonalantibody(coupledwithdye2)atdifferentmaturationstages,thensubjectthecellpopulationtoFACS.FlowCytometrydotplotswillbegenerated.第四十五页，共七十五页，2022年，8月28日0.111010010000.11101001000dye1intensity(forCD4)dye2intensity(forCD8)DoubleNegative(CD4-,CD8-)Doublepositive(CD4+,CD8+)Singlepositive(CD4-,CD8+)Singlepositive(CD4+,CD8-)dieTcell(CD4-,CD8-)die第四十六页，共七十五页，2022年，8月28日G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle

PurdueUniversityCytometryLaboratories第四十七页，共七十五页，2022年，8月28日4hr,control28hr,irradiatedG1:94.1%S:1.5%G2/M:4.4%G1:94.1%S:1.1%G2/M:4.8%G1:60.6%S:34.9%G2/M:4.5%G1:96.6%S:1.6%G2/M:1.8%10%1%90%4%28hr,control28hr,aphidicolin第四十八页，共七十五页，2022年，8月28日免疫组织化学法原理：组织细胞内蛋白质等组分被原位固定以特异性抗体识别待检蛋白并显色方法：组织细胞固定：4%多聚甲醛，RT10min通透性处理：0.5%Triton-X100，RT10min封闭：5%马血清、5%羊血清等，37°C15min一抗：关键二抗：荧光标记封片，观察第四十九页，共七十五页，2022年，8月28日NPATconcentratesatafewfociinthenucleiofhumancells第五十页，共七十五页，2022年，8月28日G0G1SG2PrometaphaseAnaphaseCellcycle-dependentchangeofNPATlociinWI38cells第五十一页，共七十五页，2022年，8月28日Figure7:IR-induceddispersionofNPATproteinfromhistonegenelocidependsonp53andp21.第五十二页，共七十五页，2022年，8月28日Figure8:InhibitionofCdk2activitypreventsNPATfociformation.第五十三页，共七十五页，2022年，8月28日优缺点：优点：不仅可以定性，更重要的是可以定位缺点：无法检测表达量低的蛋白质难以定量高度依赖于抗体操作过程比较复杂应用：蛋白定位在哪里？去哪里？其它第五十四页，共七十五页，2022年，8月28日NorthernBlot原理：将RNA固定于尼龙膜上以DNA探针识别待检mRNA尼龙膜AEDCBRNABBB同位素标记的DNA探针第五十五页，共七十五页，2022年，8月28日2.操作过程总RNA提取：用RneasyMiniKit抽取总RNA（QIAGEN公司）用700ulSW1洗一次用500ulRPE洗2次用50ulRNasefreeddH2O洗脱两次取2ul加入98ulddH2O，测取OD260/280并计算RNA浓度及总RNA得量制胶（变性1－1.5%Agarose胶）：制备100ml含有2.2mol/L甲醛的1.5%的琼脂糖凝胶，加1.5克琼脂糖凝胶粉到72ml灭菌水中，煮沸溶解后置55℃水浴，均衡后10mlMOPS电泳缓冲液和18ml去离子甲醛，在化学通风橱内灌胶加入足够量的1XMOPS电泳缓冲液，预电泳约5分钟。备用。第五十六页，共七十五页，2022年，8月28日RNA样品预处理：在一灭菌EP管中建立变性反应：RNA（多达20ug） 2.0ul10XMOPS电流缓冲液 2.0ul甲醛 4.0ul甲酰氨 10.0ul溴化乙淀 1.0ul65℃20分钟变性，立即置冰上10分钟简短离心后备用电泳：上样：等量总RNA/样品4－5volts/cm电泳5－7小时。不能用过高的电压！转移：经典方法：搭建“金字塔”，转移过夜。第五十七页，共七十五页，2022年，8月28日

重物（400克）琼脂糖凝胶滤纸滤纸桥尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板支持物20XSSC上行毛细管转移示意图第五十八页，共七十五页，2022年，8月28日DNA探针的制备：在一灭菌EP管中建立反应：2.0ul 模板－GAPDHPCR产物（150bp,100ng/ul）6.0ul 10XEcoPolbuffer6.0ul dNTPs（无dCTP）3.0ul 5’-GAPDH(100ng/ul)3.0ul 3’-GAPDH(100ng/ul)31.0ul ddH2O煮沸10分钟，立即置冰上10分钟：加入： 2.5ul Klenow 6.5ul 32P-dCTP室温下孵育6小时过柱纯化已标记探针（Phamarcia试剂盒）第五十九页，共七十五页，2022年，8月28日取相等CPM量RNA，加入2mlTES/0.6MNaCL10mMTES10mMEDTA0.2%SDS在杂交炉中，68℃反应过夜用2XSSC/0.1%SDS洗膜三次用0.1XSSC/0.1%SDS洗膜三次曝光于X光胶片Crosslink预杂交加入10ml杂交混合液，68℃反应45分钟杂交第六十页，共七十五页，2022年，8月28日H2AH3H4GAPDH0hr2hr4hr6hr8hr10hr12hr14hrTimeafterirradiationC.H2BH1DNAdamageinducesdown-regulationofhistonegenetranscriptionwhichparallelscellcyclearrestHCT116（p53+/+,p21+/+)第六十一页，共七十五页，2022年，8月28日D.E.0hr2hr4hr6hr8hr10hr12hr14hr24hrH2AH4GAPDHTimeaferGFP-p21inductionH1H2BH3InhibitionofCDKactivitydispersesNPATfromhistonegenepromotersanddown-regulateshistonegeneexpression第六十二页，共七十五页，2022年，8月28日A.0204060801001200468101214Timeafterirradiation(hr)%controlSphaseH1H2AH2BH4H2AH4GAPDHH2BH10hr4hr6hr8hr10hr12hr14hrTimeafterirradiationHCT116（p53-/-,p21+/+)Down-regulationofhistonegeneexpressioninducedbyDNAdamagedependsonp53andp21第六十三页，共七十五页，2022年，8月28日SphaseH1H2AH2BH4BH2AH4GAPDHH2BH1Timeafterirradiation0hr2hr4hr6hr8hr10hr12hr14hr020406080100120%control0468101214Timeafterirradiation(hr)2HCT116（p53+/+,p21-/-)Down-regulationofhistonegeneexpressioninducedbyDNAdamagedependsonp53andp21第六十四页，共七十五页，2022年，8月28日优缺点：优点：真实反映细胞处理后mRNA水平的变化敏感性较高缺点：使用同位素不能反映蛋白质变化的最终结果及mRNA变化的原因多用于检测细胞内较高丰度mRNA的变化实验过程较为复杂应用：观察细胞处理后mRNA水平的变化，以印证蛋白质的变化第六十五页，共七十五页，2022年，8月28日Nuclei

Run-on原理：迅速冷冻，使细胞核内正在转录的mRNA复合体处于冻结状态加入ATP/GTP/CTP/32P-UTP，重新恢复mRNA的转录并使之结束（标记冻结