大麦萌发前后淀粉酶活力测定

实验目的

学习分光光度计的原理和使用方法。掌握淀粉酶活力测定的一般方法。了解大麦萌发前后淀粉酶活力的变化。第1页/共12页实验原理

几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解生成麦芽糖。第2页/共12页淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖与3，5-二硝基水杨酸（DNS）的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3，5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。休眠种子的淀粉酶活力很弱，但经吸胀萌发后，淀粉酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。本实验通过测定大麦种子萌发前后的淀粉酶活力，来了解此过程中淀粉酶活力的变化。第3页/共12页仪器、原料和试剂

仪器：小台秤；具塞刻度试管25ml×13；；研钵；容量瓶50ml×2、100ml×1；离心机；分光光度计；恒温水浴；移液管。原料：大麦种子第4页/共12页试剂：（1）麦芽糖标准液（1mg/ml）：称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml（要求严格仔细操作）；（2）0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液：

A液（0.1mol/L柠檬酸）—称取分析纯柠檬酸21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；

B液(0.1mol/L柠檬酸钠)—称取柠檬酸钠29.41g用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55ml与B液145ml混匀，即为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液；（3）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液中。（4）3，5-二硝基水杨酸（DNS）：精确称取1g3，5-二硝基水杨酸溶于20ml2M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml，盖紧瓶塞，防止CO2进入。若溶液混浊，可过滤。第5页/共12页实验步骤种子萌发：大麦种子浸泡2.5h后，放入25℃恒温箱内或室温下发芽。大麦萌发所需要的时间与品种有关。若难以萌发，可适当延长浸泡时间和发芽时间。酶液提取：称取萌发3天的大麦种子1.0g（芽长1.0~1.5cm），置研钵中，加少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨成匀浆后转入离心管中，用8ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟振荡1次，使其充分提取。然后3000r/min离心10min，取上清液倒入50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml，放入50ml容量瓶中（稀释程度视酶活性大小而定），用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液，进行酶活力测定。取干燥种子或浸泡2.5h后的种子1.0g作为对照，按上述步骤进行提取操作。第6页/共12页麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表加入试剂：置沸水浴中加热5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至25m1。混匀后以1号管为对照用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。试剂管号1234567麦芽糖标准液（ml）00.20.61.01.41.62.0蒸馏水2.01.61.41.00.60.20麦芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.62.0DNS（ml）2.02.02.02.02.02.02.0第7页/共12页4．酶活力测定：取25ml刻度试管5支，编号，按下表要求加入试剂。摇匀，置于水浴中煮沸5min,取出后流水冷却，加蒸馏水定容至25mL。摇匀，以5号管为对照在520nm波长下比色，记录光密度值，从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，用以表示酶活性。第8页/共12页试管标号试剂加入量/ml12345干燥种子的酶提取液干燥种子的酶提取液重复萌发幼苗的酶提取液萌发幼苗的酶提取液重复空白管酶稀释液1.01.01.01.00DNS（ml）00002.0预保温将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min1%淀粉溶液11111保温在40℃恒温水浴中准确保温5min

DNS（ml）2.02.02.02.02.0第9页/共12页计算

根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：

A标准/A未知=C标准/C未知，则

C（酶液管浓度）=A酶×C标准/A标准式中C—浓度；

A—光吸收值第10页/共12页注意事项

在实验中要严格控制时间和温度，以减小误差。为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，在依次立即加入DNS纪录吸光值，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的大麦种子，比较