《分子生物学》研究生课件复件 ln-蛋白质分子的折叠和定位

李宁青岛大学医学院生化教研室Golgiapparatus(red）EndoplasmicReticulumMitochondriaPeroxosomes(green)第一章蛋白质分子的折叠和定位在细胞内核糖体上合成的多肽链是如何折叠成三级结构的？它们又是如何形成四级结构的？每个蛋白质分子只有在特定的细胞部位才能发挥功能。不同的蛋白质是如何进行定位的？这是本章重点讨论的问题。第一节蛋白质分子的折叠一、蛋白质折叠问题

一条从核糖体上合成的具有特定序列的多肽链是怎样折叠成具有特定空间结构的蛋白质，即天然构象的？是目前尚未解决的一个重大课题。如果肽链折叠发生异常，不仅不能发挥正常的生物学功能而且必然导致蛋白质的聚集而引起疾病。

镰刀形细胞贫血病疯牛病-朊病毒

20世纪60年代，Anfinsen根据牛胰核糖核酸酶体外的变性与复性的实验结果，提出了蛋白质的一级结构决定了蛋白质的空间结构和生物学功能，即蛋白质在体外的折叠是自发进行的。

对细胞内新生肽链折叠的机制而言，必须解决下列问题：1、体内新生肽链的折叠是否也是自发进行的？2、一级结构与空间结构中间是否存在一对一的折叠密码关系呢？怎样破译？3、新生肽链的折叠是何时开始的，是伴翻译过程还是翻译后过程？（一）、从热力学角度研究蛋白质折叠从热力学角度讲，蛋白质之所以能自发折叠是因为体系的自由能降低，天然构象是能量最低的状态。“自组装”热力学假说：蛋白质一级结构决定高级结构

通过非共价键折叠好的蛋白质使自由能下降，但下降不会太大，一般介于10-50kJmol-1。这也是绝大多数蛋白质不稳定的原因。

但有些特殊蛋白质相当稳定，这类蛋白质分子折叠的热力学特征值得研究。

（二）、从动力学角度研究蛋白质折叠

蛋白质折叠的动力学悖论：不是随机的而是受动力学控制

蛋白质折叠的动力学学说：

动力学折叠中间体折叠中间体。。。天然构象二硫键重排、辅氨酰顺反异构化

（三）、能级形貌理论和谐诠释蛋白质折叠蛋白质各分子沿各自途径折叠，由分子构象松散、自由能大的状态经过构象塌陷、表面张力或疏水作用形成紧凑结构，最终形成自由能最小、构象熵最小、热力学最稳定的、唯一的天然构象。二、折叠模型成核-快速生长模型拼图模型框架模型快速疏水垮塌模型扩散-碰撞-缔合模型动力学模型格点模型成核-快速生长模型拼图模型框架模型快速疏水垮塌模型扩散-碰撞-缔合模型动力学模型三、蛋白质折叠受内在因素外部条件制约1、氨基酸侧链疏水性氨基酸残基：疏水核

亲水性氨基酸残基：氢键2、二硫键形成是蛋白质折叠的限速步骤脯氨酸顺反异构化是抑制蛋白质折叠的潜在因素3、α-螺旋形成的起始阶段是个慢过程4、单个结构域独立折叠（一）内在因素：氨基酸侧链和肽链的二级结构（二）外部条件：细胞内的特殊环境细胞内的大分子拥挤效应温度和PH影响带电状态金属离子的配位效应金属配位键体外蛋白质折叠与细胞内新生肽链折叠的差别四、蛋白质折叠需要其他辅助因子蛋白质在体内的折叠相当迅速，如果不迅速折叠，蛋白质分子会被降解，或者形成无活性的聚集体。蛋白质肽链折叠可能是与翻译过程同时进行，也可能多肽链翻译过程结束之后。最近研究表明:在原核细胞中，折叠似乎是在翻译完成之后再进行的；而在真核细胞中，折叠似乎是与翻译同步进行的。分子伴侣蛋白

帮助正确折叠成中间折叠体，阻止和纠正不正确折叠折叠酶催化与折叠直接有关的化学反应分子内分子伴侣

蛋白质分子内部的前导肽

细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白辅助---即分子伴侣（chaperone）。分子伴侣的作用是可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。也促进二硫键的正确形成。（一）分子伴侣蛋白—最主要的辅助因子

大量的研究表明很多在胁迫条件（如热激或缺氧等）下被诱导产生的所谓“胁迫诱导蛋白(stress-inducedproteins)”或“热休克蛋白(heatshockproteins,简写为HSP”都具有分子伴侣活性。

核质素触发因子（triggerfactor，TF）内质网中的(calnexin、Bip、Grp94）定义：分子伴侣是指一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份，分子伴侣本身不包括控制正确折叠所需的构象信息，但是能阻止非天然态多肽链的错误折叠或凝集，给处在折叠中间体的多肽链提供更多正确折叠的机会。1、热激蛋白HSP70和HSP40以ATP依赖方式参与折叠大肠杆菌中同源蛋白DnaK,需要辅伴侣（DnaJ、GrpE）生物学功能：依赖于ATP的方式结合和释放非天然构象多肽的疏水片段，并能通过遮蔽这些片段而稳定蛋白质的松弛构象和阻止聚集。蛋白的跨膜运输：多肽链在跨膜运输前通常处于松弛构象状态，当多肽的前导链通过蛋白质通道进入线粒体内腔时，基质中的一分子HSP70立即与多肽上适当片段结合，防止其后退滑回细胞质，拖拽前导链促进整个蛋白质进入线粒体2、分子伴侣素HSP60和HSP10形成圆筒状复合体辅助蛋白折叠，原核同源物为GroEL和GroES.3、触发因子（triggerfactor，TF）是与核糖体结合的分子伴侣识别新生肽链疏水性氨基酸序列，形成新生肽链结合复合物（NAC）使延长中的肽链不会过早折叠

分子伴侣功能：阻止新生肽链的不正常聚集阻止胁迫条件下的蛋白质分子聚集帮助寡聚体蛋白质的组装帮助蛋白质分子的跨膜转运使聚集的蛋白质分子解散使蛋白质分子维持一定的构象分子伴侣与酶（二）折叠酶二硫键异构酶（proteindisulfideisomerase，PDI）

分子伴侣活性与酶活性部位无关与底物的结合是瞬间的，通过反复的快速结合-解离阻止新生肽链的聚合或错误折叠释放底物不需要ATP肽基-脯氨酰顺反异构酶(peptidyl

prolyl

cis-transisomerase，PPI)功能：帮助脯氨酸弯折处形成正确折叠分类：亲环蛋白FK560结合蛋白

细蛋白作用机理：催化Xaa-Pro键的顺反异构体之间的转换（三）分子内分子伴侣（intromolecularchaperone，IMC）具有前导肽（pro肽）的蛋白质的前体形式直接将酶和底物连接在一起，将催化反应变成一个分子内反应释放底物不需要ATP分两类：

Ⅰ参与肽链的延伸和正确折叠枯草杆菌素、α水解蛋白酶

Ⅱ参与蛋白质在胞内的转运和定位生长抑素Ⅱ、髓过氧化物酶（四）五、膜蛋白的折叠问题

膜蛋白的折叠研究比较困难，目前只有少数几个膜蛋白能成功地在体外进行变性与复性。蛋白质在膜内疏水环境中的二级结构或者全部是α-螺旋结构，或者全部是β-片层结构。

（一）根据细菌视紫红质蛋白的研究结果提出了这种α-螺旋跨膜结构蛋白折叠的“二阶段模型（two-stagemodel）”：先形成一个α-螺旋核心，其他α-螺旋再通过螺旋-螺旋相互作用而结合到核心结构上去。

对于只是部分插入到膜中的外周膜蛋白的折叠，一般认为在插入之前，蛋白质分子要进行部分折叠。易位子不仅参与蛋白质的跨膜转运，也参与协助膜蛋白的折叠。（二）膜蛋白在膜中的二级结构也可以全部是β-片层结构

多为通道蛋白，由信号肽引导，以成熟的蛋白形式分泌到细胞质中，然后插入到膜中。

第二节

蛋白质的定位蛋白质的靶向输送(proteintargeting)

蛋白质合成后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。一、蛋白质分子携带有不同的定位信号

所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列亦称信号肽。

对于分泌蛋白质来讲，信号序列位于N端；对于非分泌蛋白质来讲，信号序列可位于肽链的N端、中间或C端。信号序列不都是肽链中短暂存在的，有的信号序列永久存在于蛋白质分子中。

20世纪70年代，Blobel提出了“信号肽假说”，该学说认为，每一种蛋白质在真核细胞器中的定位是通过新生肽链中短暂存在的信号序列协助完成的，这种信号首先在分泌蛋白的N－末端发现，该信号序列能被胞质中的信号肽识别颗粒（SRP）识别与结合，然后将正在合成中的“分泌蛋白质”带到内质网腔中，之后，信号肽被特异的肽酶切去，“分泌蛋白”在内质网腔中经过折叠、组装和修饰后被经由高尔基体输送到细胞外面、溶酶体中、内质网腔、高尔基体腔、整合到这些细胞器的膜上、或是细胞质膜上。TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1999GünterBlobel1971ProteinshaveintrinsictopogenicsignalsgoverntheirtransportandlocalizationinthecellSignal/Translocase/Energy(一）、线粒体蛋白的定位

1、线粒体蛋白质N端带有定位信号

90%以上的线粒蛋白前体在胞液合成后输入线粒体基质、内膜、膜间腔或外膜。

基质和内膜蛋白只具有基质靶向序列。膜间腔蛋白除了该序列之外还有膜间质靶向序列。外膜蛋白除了该序列之外还有停止转运和外膜定位序列

二、不同的定位信号引导蛋白质转运到不同的细胞部位线粒体基质导入序列的特点是：①多位于肽链的N端②富含带正电荷的氨基酸③对所牵引的蛋白质没有特异性要求，非线粒体蛋白连接上此类信号序列，也会被转运到线粒体。

信号序列定位转运装置信号序列位置位于N端，富含带正电荷的氨基酸，形成两性α螺旋，完成转运后被切除。基质靶向序列基质及内膜TOMTIM柠檬酸合酶细胞色素C氧化酶含疏水性的停止转移序列，被安插到外膜。不被切除，基质靶向序列

+停止转运和外膜定位序列外膜TOM

外膜孔道蛋白含两个信号序列，首先转运到基质，第一个信号序列被切除，第二个信号序列引导蛋白进入膜间隙，后被切除。基质靶向序列

+膜间质靶向序列

膜间质TOMTIM细胞色素C

线粒体的蛋白转运装置——TOM和TIM复合体

①TOM复合体（外膜转运酶复合体）

负责通过外膜，进入膜间隙，②TIM复合体（内膜转运酶复合体）负责将蛋白质转运到基质，也可将某些蛋白质安插在内膜进入基质的蛋白质可以先通过TOM复合体进入膜间隙，然后通过TIM复合体进入基质。也可以通过线粒体内、外膜间的接触点（鼠肝直径1um线粒体上约115个接触点），一步进入基质，在接触点上TOM与TIM协同作用完成蛋白质向基质的输入.

线粒体内外膜的接触点

蛋白质分子进入线粒体基质的模型：1、前体蛋白在核糖体合成，进入胞液2、分子伴侣蛋白结合前体蛋白3、信号序列与TOM识别，被转运跨过外膜4、前体蛋白在膜间质与TIM接触，被转运进入线粒体基质5、基质靶向序列被水解，蛋白折叠形成天然构象

线粒体膜间质蛋白转运：

转运开始与基质蛋白相同，当抵达TIM后：A.前体蛋白先进入线粒体基质，基质导入序列被切除，膜间质导入序列使蛋白通过内膜上的复合体被送回到膜间质，膜间质导入序列被切除后，蛋白折叠成天然构象。B.只有前体蛋白的基质导入序列进入基质被切除，膜间质导入序列进入内膜也被切除，未进入内膜的膜间质蛋白释放在膜间质。以上转运机制是高度保守的转运系统缺陷可导致人体疾病线粒体外膜和内膜蛋白的转运机制现在不清楚（二）细胞核蛋白质的定位

细胞核蛋白在胞液合成后，通过核孔复合物输入核内。

靶向输送的核蛋白多肽链内含有特异的信号序列，称为核定位序列NLS（nuclearlocalizationsignal）。

NLS可位于肽链的不同部位，在蛋白质进入核定位后不被切除。NLS为4—8个氨基酸残基的短序列，富含带正电荷的赖、精氨酸或脯氨酸，不同NLS间未发现共有序列。该序列是在SV40中的T抗原上发现的。

许多蛋白质在其序列上也有共同的信号类型，负责把蛋白质从细胞核转运至细胞质，这些模体称为核输出信号(nuclearexportsignal，NES)，10个aa左右，含有一组保守的亮氨酸组合模式。核蛋白靶向输送需要输入因子α、β和一种小GTP酶Ran蛋白参与。输入因子αβ杂二聚体输入蛋白importin可作为胞核蛋白受体，识别结合NLS序列。输送过程：1）胞液合成胞核蛋白结合输入因子αβ二聚体形成复合物，并被导向核膜的核孔。2）由小GTP酶Ran水解GTP释能，胞核蛋白输入因子复合物通过耗能机制跨核孔转位，进入核基质。3）转位中，输入因子β和α先后从上述复合物解离，胞核蛋白定位细胞核内。输入因子α、β移出核孔再被利用。

Ran-GAPRan－GTPRan-GDPRan核苷酸交换因子金标记的核质素穿越核孔蛋白质通过细胞核孔复合体进入细胞核（三）过氧化物酶体蛋白的定位在细胞液中自由核糖体上合成。折叠好后进行转运三信号肽段1、C-末端有一保守的SKL序列，例如过氧化氢酶，脂酰辅酶A氧化酶。蛋白进入后不会被切除。2、过氧化物酶体靶向信号1（peroxisome-targetingsignal1，PTS1）,加到C-末端,足以进入过氧化物酶体，蛋白进入后被切除。3、N-末端的一段序列，PTS2，例如硫解酶，蛋白进入后被切除。Zellweger综合症（四）分泌蛋白的定位真核细胞分泌蛋白等前体合成后靶向输送过程首先要进

粗面内质网。DestinationsineucaryoticcellsImportExport

各种新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列称信号肽，约13—36氨基酸残基分为三段。N端为碱性区，含有一到二个碱性氨基酸残基；中间为疏水核心区，约10—15个氨基酸残基，主要为疏水中性氨基酸；C端为加工区，多含极性、小侧链氨基酸，紧接着是被信号肽酶裂解的位点。信号肽(signalpeptide)信号肽的一级结构靶向输送蛋白的信号序列或成分靶向输送蛋白信号序列或成分分泌蛋白N端信号肽内质网腔蛋白N端信号肽，C端-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-(KDEL序列)线粒体蛋白N端信号序列（20～35氨基酸残基）核蛋白核定位序列（-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-，SV40T抗原）过氧化酶体蛋白C端-Ser-Lys-Leu-（SKL序列）溶酶体蛋白Man-6-P（甘露糖-6-磷酸）KEDLR-GFP激光共聚焦显微镜下的ER分泌蛋白质进入内质网，需要多种蛋白质成分参与。1）存在于胞液中的信号肽识别颗粒（SRP）由6个亚基和1个7SRNA组成的核蛋白，可结合GTP且具有GTP酶活性。2）存在于内质网膜上的SRP受体可结合SRP，又称为SRP对接蛋白（DP），DP有α、β亚基，其中α亚基可结合GTP且具有GTP酶活性。3）存在于内质网膜上的核糖体受体可与核糖体大亚基结合，使其锚定在内质网膜上。4）肽转位复合物为多亚基的ER膜蛋白，可形成新生肽链跨ER膜的蛋白通道。分泌蛋白进入内质网的过程：1）在胞液游离核糖体上以mRNA为模板，合成出N端包括信号肽约70个氨基酸残基。