核酸分子探针

红细胞:

6,000-9,000nm白细胞:

10,000nm一般细菌:

1,000–10,000nm

一般病毒:

75–100nm蛋白质：

5–50nmDNA(双链宽)：

2nm谋求灵敏、准确地在分子层面，以致在活体内，将生物分子的成分、结构、相互作用等信息转变为易于检测的光、电等信号变化。尺度和量的概念1951年，英国科学家威尔金斯和富兰克林利用X射线衍射技术拍摄到了DNA晶体照片。

1952年，奥地利科学家查哥夫研究指出：生物DNA中，碱基A和T的含量总相等，G和C的含量相等。1953年，美国科学家沃森和英国科学家克里克在Nature杂志上发表了DNA的双螺旋结构（20世纪生物科学最伟大的发现）。1962年，沃森、克里克和威尔金斯获得诺贝尔生理学或医学奖。DNA双螺旋结构模型的提出标志现代分子生物学的诞生。

历史回顾：DNA双螺旋结构是怎样发现的？DNA分子的特点：

稳定性：脱氧核糖和磷酸交替连接方式不变，碱基配对原则不变，可反复变性和复性。

多样性：DNA分子碱基对的排列顺序千变万化，一天n个碱基的DNA分子排列方式有4n种。

特异性：基于碱基配对原则，DNA能特异性识别与其完全互补的DNA或RNA序列。合成和标记简单且已经自动化和市场化。核酸分子的优越性质：1.Watson-Crick碱基互补配对，金属-碱基对，G或C四聚体等；2.作为生物催化剂（核酶），与蛋白酶发生特异性相互作用；3.可人工合成，便于修饰和衍生化功能分子（锁核酸等）；4.核酸适配体---基于核酸的特定空间构型特异性识别靶分子

（离子、蛋白、细胞等）；5.与纳米结构结合，用于肿瘤等的成像和治疗研究；6.临床应用等目标DNA1.1Watson-Crick碱基互补配对—分子信标

分子信标是个呈发夹结构、设计十分巧妙的短链DNA分子。由于它特殊的结构，自从1996年被首次合成出来以后，它已经被非常广泛地应用于PCR定量、基因分型、基因芯片、活细胞内mRNA分析以及蛋白质（酶）研究等领域。分子信标的工作原理：K.Wang,W.Tan,etal.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,856

无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和淬灭基团相互靠近，发生FRET，荧光淬灭。加入靶序列后，分子信标环部与之互补配对形成刚性并且更稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团距离增大，阻止FRET发生，荧光恢复。E:FRET效率R:荧光给体与受体之间的距离J.Huang,K.Wang,W.Tan,etal.

Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,401杂交链式反应用于DNA的高灵敏检测---Watson-Crick碱基互补配对

杂交链式反应用于DNA的比色检测

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Watson-Crick碱基互补配对P.Liu,X.Yang,K.Wang,etal.Anal.Chem.2013,85,7689−7695L.He,X.Yang,K.Wang,etal.

Chem.Commun.,2014,50,7803--7805Watson-Crick碱基互补配对启发的自组装构型开关用于核酸杂交调控1.2金属-碱基对T-Hg2+-T的结构C-Ag+-C的结构AngewandteChemieInternationalEdition,2004,43(33):4300-4302ChemicalCommunications,2010,46(9):1476-1478AnalyticalChemistry,2009,81(6):2144-21491.3G四聚体G-quadruplex–aptamerasadrugdeliverycarrierAngew.Chem.Int.Ed.2011,50,6098–61012.1作为生物催化剂（核酶）---核酶探针如上图，由于DNAzyme与底物链发生分子内杂交,荧光基团与猝灭基团相互靠近,导致荧光猝灭.当Pb2+存在时,DNAzyme被激活,底物链被切断后释放出荧光基团标记的DNA片段,从而产生明显的荧光信号.据此可在常温下快速检测Pb2+,检测下限为10nmol/L.

核酶（Ribozyme）是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特定RNA序列。它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。有一些DNA分子同样具有催化功能。1981年由Cech等人在研究四膜虫前体rRNA拼接机制时发现，并因此获得1988年诺贝尔化学奖。MolecularBeaconOligoALigationHybridABOligoBBindingNTFSNTFS(NucleotideFragmentSense)平台技术实时监测核酸的连接过程该平台还被用于核酸磷酸化过程监测，NAD等的高灵敏检测2.2与蛋白酶发生特异性相互作用---核酸片段检测（NTFS）平台技术（NucleicAcidRes.,2003,31,e148;NucleicAcidRes.,2005,33,e97；Analyst,2005,130,350-357;Anal.Biochem.,2006,353,141-143;BiomedicalPhotonicsHandbook,2003,p57-1~57-23,）Z.Tang,K.Wang*etal.Anal.Chem.,2011,83,2505利用E.ColiDNA连接酶具有对NAD的高度依赖性，检测NAD+Q.Guo,

X.Yang,K.Wang,etal.NucleicAcidsRes.2009,37,e20.基于DNA聚合酶的链置换聚合反应用于DNA的高灵敏检测硫代化核酸结构示意图2’-O-甲基RNA结构示意图肽核酸结构示意图锁核酸结构示意图衍生物类型抗酶切能力选择性杂交亲和力荷电性非特异性结合毒性硫代化核酸较强中稍微降低负电高高毒性2’-氧甲基RNA较强中稍微增强负电高低毒性肽核酸强高强中性低低毒性锁核酸极强高强负电底无毒性核酸衍生物性能比较3.核酸衍生物的性能结合条件可控修饰灵活亲和力高筛选周期短，成本低靶分子种类广泛特异性强分子量小，无免疫原性

稳定、易保存4.核酸适配体Aptamar----”ChemicalAntibody”Theoretically,anythingweuseantibodiestoday(formolecularrecognition,molecularinteraction,diagnosis,andtherapeutical)canbereplacedwithsyntheticDNAprobeswhichcanbepreparedreproduciblyinourlabsusingaDNAsynthesizer.

核酸适配体：由15-60个碱基组成的能特异识别靶分子的单链DNA/RNA，识别对象包括小分子、蛋白质、细胞等。Designer

DNA/RNA核酸适配体的定义核酸适配体靶分子ATP核酸适配体

分子识别的基础不是碱基互补配对折叠成特定的二级与三级结构空间结构与靶分子构象匹配J.Liu,X.Yang*,K.Wang*,etal.Anal.Chem.2013,85,11121−11128Aptamer辅助的量子点自组装用于ATP的荧光传感小分子ATP

aptamerQ.Wang,X.Yang*,K.Wang*,etal.Anal.Chem.2014,86,6572−6579正/反筛集成的微流控芯片用于肌红蛋白aptamer的筛选肌红蛋白aptamerJ.Huang,K.Wang,W.Tan,etal.Anal.Chem.2010,82,10158将aptamer序列嵌入到分子信标的互补链，与目标识别时发生竞争反应，可以引起构型变化，分子信标恢复发夹结构，释放信号。溶菌酶aptamer细胞膜蛋白触发构型变化的激活式核酸适体探针，用于肿瘤活体荧光成像。检测原理示意图

创新性提出了“激活式核酸适体探针”概念，该探针与传统“alwayson”核酸适体探针相比，有效降低了非特异性背景信号，在肿瘤部位产生了更高的对比度并大大缩短诊断时间，有望为实现肿瘤早期诊断提供一种更为灵敏的检测方法。Cellaptamer5.与纳米结构结合，用于肿瘤等的成像和治疗研究分子信标用于果蝇卵母细胞内mRNA成像PNAS,2003,100,13308核酸适体用于肿瘤细胞的识别PNAS,2006,113,11838