免疫组织化学及相关技术之检测细胞凋亡的方法

《免疫组织化学及相关技术》细胞凋亡及其检测方法

检测细胞凋亡的方法（一）凝胶电泳法正常细胞：genomeDNA

凋亡细胞：DNAladder

坏死细胞：DNAsmear

LM-PCR原理：

凋亡细胞因内源性核酸酶激活而产生单股或双股断链DNA。在细胞或组织中加入外源性核苷酸（标记），通过某种酶的催化，外源性核苷酸与凋亡细胞的单股或双股断链DNA相结合，最后通过一定的显示系统使之显示出来，从而鉴别凋亡细胞。

不考虑所用的催化酶时，统称为原位末端标记(ISEL)

。(二)原位末端标记法（insituend-labeling，ISEL）1.末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT）

（TUNEL法）2.DNA聚合酶I或Klenow大片段介导的原位缺口平移（insitunicktranslation,INST法）(二)原位末端标记法（insituend-labeling，ISEL）

1.TUNEL法TUNEL：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnickendlabeling)。基本原理：TdT能将外源性的FITC、生物素或地高辛标记的dUTP连接到凋亡细胞核的DNA断链的3’-羟基(3’-OH)末端（DNA断链可是单股断链，也可是双股断链）。因此，TUNEL法可检测凋亡细胞核中的单股和双股DNA断链，用于组织切片及培养细胞的原位检测。FITC标记的dUTP与细胞内DNA断裂处结合

用结合了过氧化物酶(POD)的抗荧光素抗体与之反应用POD的底物DAB显色TUNEL反应原理

1．器材:

恒冷箱切片机或石蜡切片机，光学显微镜，冰箱，温箱。2．主要材料和试剂:

昆明小鼠，OCT包埋液，TUNEL试剂盒，乙醇，多聚甲醛，甲醇，TritonX-100等。3．操作步骤（略）（1）组织标本制备：（2）将组织切片从冰箱中取出，室温干燥30min。入新鲜配制的4%多聚甲醛（pH7.4PBS配制）。室温固定30min。（3）PBS洗3次，5min/次。TUNEL实验简介（4）0.3%H2O2甲醇30min，封闭内源性过氧化物酶。（5）入0.1%TritonX-100枸橼酸钠缓冲液中

冰浴2min。（增加细胞通透性）（6）PBS漂洗3次，5min/次。（7）加TUNEL反应混合液37℃反应1-1.5h。（8）PBS漂洗3次，5min/次。（9）加POD反应液37℃，30min。（10）PBS漂洗3次，5min/次。

（11）DAB显色510min（12）甲基绿（或苏木精）复染核，脱水，透明，封片，镜检TUNEL实验简介TUNEL法显示2GyX射线全身照射12h后，小鼠胸腺皮质中可见大量TUNEL阳性的凋亡细胞。

TUNEL实验结果分析-1TUNEL实验结果分析-2荧光易衰减可过流式计数定量不能长期保存先荧光观察，再DAB显色观察，可长期保存。TUNEL实验结果分析-3FITC标记dUTPTUNEL法结果TUNEL实验结果分析-4（巨噬细胞标记）TUNEL实验结果分析-4TUNEL应用（1）石蜡切片：需经0.15mol/LPBS配制的20μg/ml蛋白酶

K消化，时间要得当，消化时间过长，非特异性染色增加，细胞结构破坏；消化时间过短，细胞膜达不到应有的通透性，影响标记效果。一般以消化10-20min

为宜。细胞涂片/冰冻切片TritonX-100处理。（2）阳性对照：经过固定和通透处理的样品用DNaseI

处理使之产生DNA断端，其他同。（3）阴性对照：在加TUNEL反应混合液的步骤时，加不含TdT的标记反应液，其余同。（4）TUNEL反应混合液：需在使用前立即制备，不能储存配好的此液体必须放在冰浴中。（5）POD反应液：一旦融化，需4℃保存，不能反复冻存。TUNEL实验注意事项（6）区分假阳性：若组织细胞坏死时亦可出现DNA断裂,TUNEL法检测亦可出现阳性反应,故必须结合凋亡细胞的形态学特征与细胞坏死加以判断。

结合形态学特征：

细胞凋亡时，往往呈现单个或少数几个细胞孤立地分布在组织中；具有凋亡的核特征，即核凝缩，可见一个或多个染色质团块，即凋亡小体核片段；周围或局部无炎症反应征象，这是细胞凋亡区别于坏死的最主要特征。TUNEL实验注意事项INST：DNA聚合酶I或Klenow大片段介导的原位缺口平移法（insitunicktranslation,简称INST）基本原理:

细胞凋亡时产生DNA断裂,有一粘性末端（一条游离的3’-羟基末端,另一条伸出的5’-末端）。利用Klenow大片段的5’3’DNA聚合酶活性,可将外源性的游离核苷酸（带有生物素标记）从3’-羟基末端开始经5’3’方向连接到断端上,再通过HRP标记的卵白素与之结合,经DAB显色,即可观察到细胞是否存在有核苷酸掺入的DNA断端。

2.INST法INST法基本原理图

INST法优点主要优点：（1）可检测早期凋亡，特异性敏感性高。（2）便于检测，可进行组织、细胞原位检测。特别在凋亡细胞较少，且散在分布于组织中，周围组织含有较多有核细胞，以及肿瘤组织核分裂相细胞数较多时，ISNT检测法可将凋亡细胞核染成棕色，便于识别。

（三）流式细胞术检测方法非荧光信号：细胞大小、颗粒大小多少等（三）流式细胞术检测方法荧光信号流式结果报告图

1．PI染色检测凋亡细胞的DNA含量原理：用DNA插入性荧光素碘化丙锭(PI)染色后，荧光强度与DNA的量呈较好的线性关系。用流式细胞仪检测细胞周期、细胞倍体及凋亡。

凋亡细胞在G0/G1期前出现特征性的亚(次)二倍体峰（sub-G1）。优点:

（1)可分析多个细胞或细胞核。（2)结合细胞分选术(cellsorting)，可收集凋亡细胞。细胞周期与DNA的量M期G0期流式单参数直方图图3-6FACS定量检测细胞DNA断裂的百分率。a：对照组胸腺细胞，DNA断裂百分率1.3%b：对照组淋巴结细胞，DNA断裂百分率1%c：超抗原SEB诱导组胸腺细胞，DNA断裂百分率13%d：超抗原SEB诱导组淋巴结细胞，DNA断裂百分率11.1%结果分析：PI染色-流式细胞仪分析注意事项

细胞数目应在（2～5）105/ml，不应低于1105/ml。如果在PI染色液中加入0.05%TritonX-100，则细胞预先不必固定，否则应先用70%乙醇固定30min后再用PI染色。如细胞不立即测定，可一直在4℃，70%乙醇中固定，而后再用PI染色。PI配好后应避光4℃保存。PI是强致癌剂，故PI接触过的试管及加样吸头应妥善处理2.Hoechst-PI双染色法PI染色无法观察G1期后的凋亡，也无法区分活细胞和死细胞。Hoechst33258可被活细胞摄取，与DNA结合，在紫外光下呈蓝色荧光。继后PI使死细胞着色产生红色荧光。因此根据红蓝两种荧光可分辨出三种细胞，也可计数计算凋亡百分率。（1）正常活细胞：对染料有嫌染性，蓝色和红色荧光均较少；（2）凋亡细胞：有膜通透性改变，主要摄取Hoechst染料，而呈强蓝色和弱红色荧光；（3）死细胞：由于有很强的PI嗜染性，并可覆盖Hoechst染色，而呈弱蓝色和强红色荧光。2.Hoechst-PI双染色法结果判定Hoechst（blue）

PI（red）正常细胞--凋亡细胞强弱死细胞弱强(1)试剂与溶液

1)碘化丙啶(PI)贮存液：100μg/ml,4℃避光保存备用。

2)Hoechst33258贮存液：100μg／ml4℃避光保存备用。

3)0.01mol／LPBS(pH7.0～7.2)。

(2)仪器器材流式细胞仪2.Hoechst-PI双染色法实验步骤

1)常规制备单细胞悬液。

2)加入Hoechst33258溶液，使其终浓度为1μg／ml，37℃水浴7min。

3)试管置冰上冷却，离心弃染液，用PBS重悬。

4)加入PI染液，使其终浓度为5μg／ml，试管置冰块上。

5)离心弃染液，PBS洗一次，即可用流式细胞仪进行分析。2.Hoechst-PI双染色法实验步骤2.Hoechst-PI双染色法结果分析

3.AnnexinV-FITC/PI双染色法

AnnexinV-FITC标记基本原理:

正常情况下，磷脂在细胞膜上分布不均匀，卵磷脂和鞘磷脂主要分布在细胞膜的外层,而磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS

）则分布在细胞膜的内层。起初发现，受损及老化的红细胞表面PS外翻，从而被巨噬细胞特异地识别吞噬。后发现凋亡细胞的磷脂不对称分布被破坏，也会产生PS外翻，从而被巨噬细胞清除。PS外翻是凋亡细胞共有的特征。连接素V(AnnexinV)是一种Ca2+

依赖的磷脂结合蛋白，优先结合带负电荷的磷脂酰丝氨酸PS。1992年Koopman等首次报道用FITC

耦联的AnnexinV

标记凋亡细胞表面外翻的PS，然后经流式细胞仪检测的方法。

AnnexinV-FITC标记凋亡细胞原理图

碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种不能透过完整的细胞膜、但能透过破损的细胞膜而与DNA结合的荧光染料。因此在凋亡早期PI不能进入细胞核，而凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。PS外翻存在凋亡早期细胞，也存在于失去膜完整性的凋亡晚期细胞和坏死细胞。凋亡早期细胞只能被AnnexinV标记。坏死或凋亡晚期的继发性坏死细胞则可同时被Annexin和PI标记，用流式细胞仪可定量分析被标记的凋亡与坏死的细胞数。目前，AnnexinV-FITC/PI双标法已成为检测细胞凋亡的常规方法。

AnnexinV-FITC/PI双染色法原理

AnnexinV-FITC/PI双染色法优点

细胞发生凋亡时，膜上的PS外翻早于DNA断裂发生，因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。连接素V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，连接素V联合PI法更加省时，结果更为可靠。(1)试剂与溶液

1)20μg／mlAnnexinV-FITC；20µg/ml的PI。

2)结合缓冲液：10mmol/LHepes／NaOH(pH7.4)·140mmol／LNaCl·25mmol／LCaCl2。(2)仪器

流式细胞仪。(3)操作步骤

1)培养细胞以0.1mmol/LPBS液(pH7.4)洗2次，溶于190μ1结合缓冲液中，调整细胞浓度为1×106／ml。

2)加5μlAnnexinV-FITC10μlPI，混匀，避光室温孵育15min。

3)用结合缓冲液洗1次后用流式细胞仪检测。AnnexinV-FITC/PI双染色法步骤

正常活细胞：AnnexinV-／PI-;早期凋亡细胞：AnnexinV+／PI-，（细胞膜呈绿色而细胞核不着色）中、晚期凋亡细胞和继发性坏死细胞：

AnnexinV+

／PI+

。AnnexinV-FITC/PI双染色法结果判定12Time-lapsedconfocalmicroscopicimagesofmouseT-cellsundergoingapoptosis.Theredfluorescenceisderivedfromcaspase3-likeproteasesandthegreenfluorescenceisfromAnnexin-V-FITCbindingtophosphatidylserineintheouterleafletoftheplasmamembrane.AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞仪细胞收集中出现的损伤细胞晚期凋亡和死亡细胞早期凋亡细胞正常活细胞

AnnexinV-PI检测失巢凋亡率（FCM）a.对照组b.0.001mmol/L组c.0.01mmol/L组d.0.1mmol/L组4.Rh123/PI双重染色法检测线粒体膜电位基本原理：线粒体为膜性结构，存在一定的极性，其外膜为负极，内膜为正极，存在跨膜电位。线粒体在细胞凋亡中起着枢纽作用。而线粒体跨膜电位DYmt的下降是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，在细胞核凋亡形态学特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前。基本原理：线粒体跨膜电位的存在，使一些阳离子亲脂荧光染料，如罗丹明123（rhodamine123）、DiOC6、TMRM、JC-1等可结合到线粒体基质，采用流式细胞计等检测细胞的荧光强度，荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低，荧光强度与线粒体ΔΨm呈正相关。为了解单个细胞的线粒体ΔΨm和细胞膜的完整性，细胞需经膜非通透性DNA结合荧光染料PI和由线粒体吸收的Rh123进行双重染色。4.Rh123/PI双重染色法检测线粒体膜电位

（1）器材同上。（2）材料和试剂：

Rhodamine123，PI。（3）操作步骤：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入终浓度为Rhodamine123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测荧光强度。

（4）注意事项：

1．始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。

2．与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。4.Rh123/PI双重染色法实验步骤

经流式细胞仪分析，分别以Rh123和PI的荧光强度为横坐标和纵坐标，双重染色的细胞可划分为3个细胞群:细胞膜完整和ΔΨm正常的细胞：PI-

Rh123+细胞膜完整但ΔΨm下降的细胞：PI-Rh123-细胞膜及ΔΨm均遭破坏的细胞：

PI+Rh123-

4.Rh123/PI双重染色法结果判定基本原理：JC-1也是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。JC-1是广泛用于检测线粒体跨膜电位(mitochondrialmembranepotential)ΔΨm

的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯

化的线粒体膜电位。JC-1染色检测线粒体膜电位基本原理：在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集，此时JC-1为单体，产生绿色荧光。因此可以方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，从而作为细胞凋亡早期的一个检测指标。JC-1染色检测线粒体膜电位

a.对照组b.0.1mmol/L柠檬酸镧组

HepG2失巢培养后线粒体膜电位的变化JC-1染色法实验结果将成品JC-1以DMSO配成储存液(1～5mg/ml)，储存于-20℃。用时以培养液稀释至10ug/ml终浓度。对贴壁细胞直接弃去培养液，漂洗细胞后直接加入染色液。组织可取1×106个细胞重悬于0.5mL培养基中，加入0.5mLJC-1染色工作液。37℃避光孵育10-30min。1000rpm4℃离心3min，弃上清用事先冰浴的JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次再用适量JC-1染色缓冲液(1×)重悬后，在荧光显微镜下或者激光共聚焦下观察并拍照。JC-1染色法实验步骤

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。常用的凋亡相关蛋白有：FAS，Bax、Bcl2、Bcl-X，Caspase3