高中生物竞赛课件：显微镜和显微技术

显微镜和显微技术决定显微观察效果的因素：放大倍数被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！特定条件下能辨析的两点之间的最小距离分辨率观察效果的最重要指标显微镜和显微技术决定显微观察效果的因素：放大倍数被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！特定条件下能辨析的两点之间的最小距离被观察物区别于背景的程度

与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术分辨率反差观察效果的最重要指标病毒20-200nm支原体0.1-0.3µm细菌0.5-5.0µm动植物细胞20-30µm活细胞多是无色透明的肉眼0.2mm光学显微镜0.2µm电子显微镜0.2nm扫描隧道显微镜样品制备技术直径分辨率显微镜和显微技术从细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具1.目镜2.准焦螺旋3.物镜4.载物台5.反光镜组成部分？成像原理？样品制备？显微镜和显微技术显微镜的种类普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描隧道显微镜原子力显微镜显微镜和显微技术（一）普通复式光学显微镜——组成由3部分组成：光学放大系统(目镜与物镜)照明系统(光源和聚光镜)(有时另加滤光片以控制波长范围)镜架及样品调节系统显微镜最重要的性能参数：分辨率，字母D表示决定因素：光源的波长λ物镜镜口角α(标本在光轴上的一点对物镜镜口的张角）介质折射率N

数值孔径值NA（镜口率）决定物镜性能最重要的指标（一）普通复式光学显微镜——分辨率显微镜最重要的性能参数：分辨率，字母D表示决定因素：光源的波长λ物镜镜口角α(标本在光轴上的一点对物镜镜口的张角）介质折射率N

数值孔径值NA（镜口率）决定物镜性能最重要的指标（一）普通复式光学显微镜——分辨率分辨率与所用波长成反比！最短可见光波长λ=400nm(450nm)最大物镜镜口角α=140°空气折射率N=1

分辨率D=260nm(292nm)，约为0.3μm如何提高显微镜的分辨能力？缩短波长增大数值孔径介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66油镜下，D可达0.18μm普通光学显微镜最大分辨率0.18μm。肉眼分辨能力0.25mm，光学显微镜有效的最高放大倍数只有1000-1500倍

（一）普通复式光学显微镜——分辨率最短可见光波长λ=400nm(450nm)最大物镜镜口角α=140°空气折射率N=1

分辨率D=260nm(292nm)，约为0.3μm如何提高显微镜的分辨能力？缩短波长增大数值孔径介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66油镜下，D可达0.18μm普通光学显微镜最大分辨率0.18μm。肉眼分辨能力0.25mm，光学显微镜有效的最高放大倍数只有1000-1500倍

（一）普通复式光学显微镜——分辨率很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。（二）暗视野显微镜普通光学显微镜又称明视野显微镜，其照明光线直接进入视野，属透射照明光阑样品与背景之间的反差增大暗视野显微镜特点：特殊的聚光器实现斜射照明光不直接穿过物镜，由样品反射或折射后进入物镜视野是暗的，样品是明亮的观察更容易、清晰（二）暗视野显微镜普通光学显微镜又称明视野显微镜，其照明光线直接进入视野，属透射照明光阑样品与背景之间的反差增大暗视野显微镜特点：特殊的聚光器实现斜射照明光不直接穿过物镜，由样品反射或折射后进入物镜视野是暗的，样品是明亮的观察更容易、清晰苍白密螺旋体团藻（三）相差显微镜光波的基本属性包括：波长、频率、振幅和相位；波长和频率变化è颜色不同；振幅变化è亮度不同；相位变化人眼无法觉察；相差显微镜：利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察相差显微镜：利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察A.

两束光的相位相同è相互干涉的结果使光波的振幅↑，亮度↑B.两束光的相位相反è光波的振幅↓，亮度↓（三）相差显微镜相差显微镜在普通光学显微镜的基础上，添加“环状光阑”和“相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差（三）相差显微镜（三）相差显微镜荷兰人FritsZernike(F·泽尔尼克)1930年，发明相衬方法(相差显微镜)1941年，制造出第一台相差显微镜1953年，诺贝尔物理学奖酿酒酵母草履虫（四）荧光显微镜——基本原理光镜水平上对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具荧光：分子吸收入射光能量后，电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长)，可分为自发荧光和诱发荧光滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成激发光片：光源和样品之间，只允许特定波长的激发光通过；阻断滤光片：物镜和目镜之间，只允许荧光染料所发出的荧光通过；光源和光学系统与普通光学显微镜不同核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头吸收短波长的光，发射长波长的光（四）荧光显微镜（四）荧光显微镜苍白密螺旋体（四）荧光显微镜鼠疫耶尔森菌“照亮细胞”的绿色荧光蛋白Greenfluorensentprotein)2008年，诺贝尔化学奖授予发现和修饰GFP的3位科学家美国下村修美国马丁.查尔菲美国钱永健（四）荧光显微镜电子显微镜(Electronmicroscope,EM)TheNobelPrizeinPhysics1986

观察细胞内部精细结构1932年由Ruska制成1986年获诺贝尔物理学奖透射电镜

transmissionelectronmicroscope,TEM扫描电镜

scanningelectronmicroscope,SEM电子显微镜(Electronmicroscope,EM)电子显微镜的基本知识电子束作为光源，波长一般<0.1nm电磁透镜聚焦镜筒高度真空图像通过荧光屏、感光胶片或电荷耦合器件显示和记录1、与光学显微镜的基本区别分辨率光源透镜真空成像原理光学显微镜200nm可见光，波长400-700nm玻璃透镜不要求真空样本对光的吸收形成明暗反差和颜色变化电镜0.2nm电子束，波长0.01-0.9nm电磁透镜1.33×10-3~1.33×10-5Pa样品对电子的散射和透射形成明暗反差电子显微镜的基本知识1、与光学显微镜的基本区别电子显微镜分辨率可达0.2nm人眼分辨率0.2mm，光学显微镜0.2μm，放大倍数1000，电镜0.2nm，放大倍数106，称为有效放大倍数，通过光学手段继续放大，不会得到任何有意义的信息，称为“空放大”电镜分辨率≠分辨本领分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率影响因素：生物制样技术的限制(超薄切片样品中分辨率约为切片厚度1/10，即50nm厚度切片的实际分辨率为5nm,<<电镜分辨率0.2nm)2．电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数电子显微镜的基本知识4个组成部分：电子束照明系统电子枪+聚光镜成像系统物镜+中间镜+投影镜真空系统电子枪，镜筒及记录系统内高真空记录系统荧光显示屏/感光胶片/CCD相机3．电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本知识扫描隧道显微镜

(Scanningtunnelmicroscope,STM)1981年发明，1986年Binnig和Rohrer获诺贝尔物理学奖原理：在低电压下，当两电极之间近到一定距离(d)（50nm以内）时，电极之间产生电流，称为隧道电流(I)，隧道电流I和针尖与样品之间的距离d呈指数关系，距离可转化为电流的函数被测