选修一23分解纤维素的微生物的分离

课题3分解纤维素的微生物的分离现在，我们都清醒地认识到，能源危机正在影响着我们每一个人的生活。国际油价不断攀升，导致物价随之上涨。为什么石油价格会持续上涨呢？现在，世界上的许多科学家正致力于生物燃料方面的研究。目前，第一代生物燃料以食用作物为原料，主要包括玉米、大豆、甘蔗，用可食用作物制造生物燃料是最简单可行的，因为把这些可食用作物转化为燃料的技术是现成的。然而，第一代生物燃料并非长久之计，原因很简单：没有足够的耕地能够满足制造生物燃料的原料需求。

第二代生物燃料主要以纤维素为原料。富含纤维素的原料有很多：木材废料（锯木屑、木质建筑残片）、农业废弃物（各种植物秸秆）、杂草等。这些作物耕作成本低、量大，更关键的是，这些作物的种植生产不会干扰和危及粮食生产。这些作物大多数能够在不能用作农田的边际土地上快速生长。还有一些能够在被废水或者重金属污染的土壤中生长并净化土壤，如生长周期较短的灌木柳树。一.基础知识㈠.纤维素与纤维素酶1.纤维素

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。思考：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？

纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。2.纤维素酶

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素①取二支20mL的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验②各加入一张滤纸条③各加入pH4.8、物质的量浓度为0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml甲乙④在乙试管中加入1mL纤维素酶⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h⑥结果：乙试管的滤纸条消失本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。实验分析：本实验的实验变量是什么？是如何设置对照的？㈡.纤维素分解细菌的筛选：1.方法：刚果红染色法。

刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。2.原理：该方法可以通过颜色反应直接筛选。3.优点：二.实验设计与操作㈠.实验设计：土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落①分布环境1、土壤取样：富含纤维素的环境中由于生物适应一定的环境，环境对生物有选择作用，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。②为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？(旁栏思考)③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。④讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。2、选择培养

增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。

①目的：分析书本P29纤维素分解菌的选择培养基配方，回答问题。答：用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照，或者将纤维素改为葡萄糖，菌落明显增多。或接种不分解纤维素的细菌。②思考：A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？答：是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？答：具有选择作用，本配方中以纤维素作为唯一碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用。

称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊。吸取一定的培养液（约5mL），转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。③操作：提示：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。〖旁栏思考题〗为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。3.梯度稀释4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上⑴制备鉴别培养基:配方见书本29页。操作过程见课题1（2）涂布平板：将稀释度为104～106的细菌

悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，在30℃的条件下倒置培养。5.刚果红染色法方法一：先

，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在

时就加入刚果红。培养微生物倒平板方法一中NaCl溶液的作用？过程见书〖旁栏思考题〗这两种方法各有哪些优点与不足？颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便，不存在菌落混杂问题1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素（刚果红），形成明显的透明圈。挑选产生明显的透明圈的菌落，并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－370C培养，可获得纯净培养物。6、纯化培养四、课题延伸

为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素的发酵方法有________和_________。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的_______进行定量的测定。葡萄糖液体发酵固体发酵提示：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题先通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。〖旁栏思考题〗本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？课题成果评价

（一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落：对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物（二）分离的结果是否一致：

由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。练习1、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（）A、生物结构与功能相适应的观点B、生物结构与功能整体性观点C、生物与环境相适应的观点D、生物发展进化的观点2、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（）①土壤取样②梯度稀释③选择培养④菌悬液涂布平板⑤挑选出单个菌落A、①②③④⑤B、①③②④⑤C、①②④③⑤D、①④②③⑤3、有关选择培养正确的叙述是（）A、可以增加纤维素分解菌的浓度B、可以减少纤维素分解菌的浓度C、所用培养基是固体培养基D、所用培养基是平板培养基CBA4.培养流感病毒时，应选用()A．固体培养基

B．含有多种无机盐的培养液C．活的鸡胚

D．无菌的牛肉汤5．微生物（除病毒外）需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。下列有关微生物营养的说法正确的是()A．乳酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的

B．微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因子

C．培养基中的营养物质浓度越高对微生物的增殖越有利D．生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成这些生长因子的能力往往不足CD6．在接种操作的过程中，不正确的是()A．要将接种环灼烧灭菌

B．取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌C．将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位

D．接种后还要将管口灭菌加塞7．高压蒸气灭菌的原理是()A．高压使细菌DNA变性

B．高压使细菌蛋白质凝固变性C．高温烫死细菌

D．高温使细菌DNA变性CB8．下列属于菌落特征的是…………()①菌落的形状②菌落的大小③菌落的多少④隆起程度⑤颜色⑥有无荚膜

A．①②③④B．①②④⑤

C．②③④⑥D．①②③④⑤⑥9．能排除培养基是否有杂菌污染的方法是……()A．将未接种的培养基放在实验桌上培养B．将未接种的培养基放在窗台上培养C．将未接种的培养基放在恒温箱中培养D．将已接种的培养基放在恒温箱中培养BC10、(20分)某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示。请分析回答问题：(1)培养基中加入化合物A的目的是筛选

，这种培养基属于

培养基。目的菌

选择性

某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示。请分析回答问题：（北京卷）(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的

，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是

。化合物A异养需氧某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示。请分析回答问题：(3)培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量

的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量

。

减少

增加

某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示。请分析回答问题：(4)转为固体培养时，常采用

方法接种，获得单菌落后继续筛选。

划线某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如图所示。请分析回答问题：(5)实验结束后，使用过的培养基应该进行

处理后，才能倒掉。

灭菌根据用途分选择培养基——在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长鉴别培养基——在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物。例如：伊红和美蓝,和大肠杆菌的代谢产物结合,使菌落呈黑色（老教材说法：深紫色,带有金属光泽）,鉴别大肠杆菌方法一中NaCl溶液的作用？

漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素