食品微生物检验第二章

食品微生物检验2014年3月第二章食品微生物检验条件及基本技术一.食品微生物检验条件二.微生物检验基本技术第一节食品微生物检验基本条件一、微生物检验室定义：指用于食品卫生微生物检验的实验室。（一）环境基本要求：实验室环境不影响检验结果的准确性。要求：实验室的工作区域与办公区域明显分开。食品微生物实验室生物实验室级别管理制度建设布局常用仪器及用途生物安全水平分级生物安全防护水平（biosafetylevel，BSL）分为4级，以表示实验室的相应生物安全防护水平。BSL－1：防护水平最低,普通建筑物即可，每个实验室应设洗手池。BSL-2：实验室的门有可视窗。在实验室工作区域外还应当有供长期使用的存储空间。在实验室内使用专门的工作服；应戴乳胶手套。配备高压蒸汽灭菌器，在实验室内配备生物安全柜。BSL-2生物安全水平分级BSL—3实验室：自成隔离区（有出入控制）或为独立建筑物。BSL—4防护水平最高。实验室应建造在独立的建筑物内或建筑物中独立的完全隔离区域内，该建筑物应远离城区。实验室管理制度

1．实验室应制定仪器配备管理使用制度，药品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。2．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修,严禁在冰箱内存放和加工私人食品。4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出。5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。检验室建设布局图1.办公台2.文件柜3.样品柜4.通风橱5.实验边台6，7.无菌台8.天平台9.在落地仪器区再加个高温仪器台，放高压灭菌锅、干燥箱、水浴锅、电热板等无菌室建设检验环境要求

微生物学检验室要求操作区域与办公区域分开。洗涤室、培养室、消毒间、无菌室应分开。无菌室要设有套间或缓冲间，最好设推拉门，以防空气振荡过大。微生物检验室应备有自动或脚踩式洗手池和固定的消毒设施。

（二）人员基本要求：检验人员应具有相应的教育、微生物专业培训经历，具备相应的资源，能够理解并正确实施检验。检验人员应掌握实验室生物检验安全操作知识和消毒知识。检验人员应在检验过程中遵守相关预防措施的规定，保证自身安全。注：有颜色视觉障碍的人员不能涉及辨色的实验。二、无菌室的建设（一）无菌技术1、对使用的器具及培养基的灭菌2、创造无菌环境食品微生物实验室常用仪器及用途洁净工作台（超净工作台、无菌台）是一种供人操作的通用型局部净化设备，通过风机将空气吸入，经由静压箱通过高效过滤器过滤，将过滤后的洁净空气以垂直或水平气流的状态送出，使操作区域持续在洁净空气的控制下达到百级洁净度它可造就局部高清洁度空气环境。生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。高压灭菌锅烘箱

培养箱水浴锅显微镜普通光学显微镜显微镜被用来放大微小物体的图像。一般应用于对生物、医药、微观粒子等观测。分光光度计分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量pH计离心机PCR仪原理：采用实时荧光PCR技术检测食品中是否有致病菌；灵敏度：对目标菌检测灵敏度为1个/g效率：检测过程用时2-4H主要耗材：各菌种试剂盒真空泵冰箱纯水机振荡器/均质机移液器其它仪器二、常用玻璃仪器及用具1、移液管

1ml，2ml，5ml，10ml，25ml

（一）量器类2、容量瓶

50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml3、量筒

容量（ml）10、25、50、10、25、500、1000、2000固定体积移液器

数字型可调移液器P型

4、微量取样器（二）、其他常用玻璃器皿3.5cm,7cm，9cm，15cm

1、培养皿2、试管各种试管的使用

13mmX100mm

：生化反应及凝集反应

15mmX150mm

：斜面培养

18mmX180mm：检样稀释型号150ml，200ml，250ml，500ml，1L，2L，3L

3、三角瓶

烧杯

容量（ml）：30、50、100、150、250、400、600、1000、2000、3000三、玻璃器皿的清洗和灭菌(一)、新购的玻璃器皿1、先用热肥皂水刷洗，流水冲净。2、再浸泡于１～２％的盐酸中数小时，最后用流水冲净。(二)、用过的玻璃器皿

1、含油脂器材的清洗（1）、单独高压灭菌；（2）、趁热倒去污物；（3）、倒放在铺有吸水纸的篮子上，置100℃烘箱中烤0.5h;（4）、再用5%的碳酸氢钠水煮两次，再用肥皂水刷洗干净。2、含菌试管的清洗高压灭菌后，肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。3、含菌平皿的灭菌（1）、底盖分开放，放入桶中，高压灭菌；（2）、趁热倒去污物；（3）、肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。4、含菌吸管的清洗（1）、把含菌吸管投入3%的来苏尔液内浸泡30min以上杀菌；（2）、用肥皂水洗涤一次；（3）、最后用清水冲洗干净即可。5、载玻片及盖玻片的清洗（1）将载玻片及盖玻片分别浸入5%的来苏尔液内浸泡过夜，取出水洗干净；（2）盖片用软布擦干即可；（3）染色用的载玻片要放入肥皂水中煮沸10min，再用肥皂水刷洗干净，最后用95%的酒精浸泡片刻，晾干备用。（三）、玻璃器材的灭菌（1）清洗后烘干；（2）加塞包扎；（3）灭菌:

干热灭菌:160~165℃烘箱中烤2h

湿热灭菌:121℃20min第二节食品微生物检验技术第一节细菌的大小与形态大小计量单位是微米（μm）染色革兰染色法形态球形杆形螺形光学显微镜细菌的大小与形态大多数球菌直径约为1.0μm大多数杆菌长约2-3μm，直径0.3-0.5μm大肠埃希菌

霍乱弧菌链球菌

第二节细菌的结构基本结构：核质、细胞质、细胞膜、细胞壁特殊结构：鞭毛、菌毛、芽胞、荚膜细胞膜细胞壁荚膜核糖体核质菌毛鞭毛核质（nuclearmaterial）单一密闭环状DNA分子组成球形、棒状或哑铃状化学组成DNA，RNA和蛋白质细胞质/浆（cytoplasm）核糖体质粒胞质颗粒中介体核糖体（ribosome）功能：合成蛋白质的场所沉降系数为70S：50S和30S亚基链霉素红霉素

概念染色体外的遗传物质，为闭合环状双链DNA，带有遗传信息，控制细菌某些特定的遗传性状。特点自我复制相互传递自行丢失质粒（plasmid）□贮藏营养物质□异染颗粒嗜碱性强鉴别细菌白喉棒状杆菌胞质颗粒中介体（mesosome）细胞膜内陷、折叠、卷曲形成的囊状物多见于G+细菌参与细菌分裂拟线粒体白喉棒状杆菌中介体透射电镜图×130000细胞膜（cellmembrane）半透性薄膜功能物质转运生物合成呼吸作用分泌作用细菌的结构

核

质细胞质：核糖体、质粒、胞质颗粒、中介体细胞膜

细胞壁

荚膜鞭毛菌毛芽胞

基本结构特殊结构细胞壁（cellwall)功能维持菌体外形抵抗低渗环境营养摄取和物质交换抗原性

结构G+菌G-菌肽聚糖（peptidoglycan）原核细胞所特有

革兰阳性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥啊啊AA革兰阳性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥青霉素作用点

溶菌酶作用点N-乙酰葡糖胺

N-乙酰胞壁酸革兰阴性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽侧链革兰阴性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽侧链G+菌与G-菌肽聚糖结构比较

革兰阳性菌细胞壁特殊组分：磷壁酸

膜磷壁酸壁磷壁酸革兰阳性菌细胞壁结构

脂蛋白、脂质双层、脂多糖(内毒素)革兰阴性菌细胞壁特殊组分-外膜脂多糖（LPS）

G-菌内毒素脂质A：内毒素的毒性和生物学活性的主要部分;无种属特异性核心多糖：具有属特异性特异多糖：G-菌的菌体抗原；具种特异性G+菌与G-菌细胞壁结构比较G+菌与G-菌细胞壁结构比较细胞壁 革兰阳性菌 革兰阴性菌强度较坚韧较疏松厚度 20-80nm10-15nm肽聚糖组成聚、四、五聚、四、无肽聚糖结构类型三维立体结构二维平面结构肽聚糖层数可多达50层1-2层肽聚糖含量

50%-80%5%-20%糖类含量多少脂类含量少多磷壁酸有无外膜 无有 G+

菌与G-

菌细胞壁的比较项目革兰阳性菌革兰阴性菌细胞壁的关系染色性紫色红色细胞壁对酒精的通透性抗原性主要为磷壁酸主要为外膜细胞壁的化学组成不同毒性无内毒素有内毒素为阴性菌细胞壁成分对青霉素的作用有效无效作用于肽聚糖、五肽交联桥细胞壁缺陷型（细菌L型）细胞壁受损的细菌能够生长和分裂者原生质体原生质球高度多形性，生长缓慢油煎蛋状菌落某些L型引起慢性感染细胞壁缺陷型（细菌L型）的特点着色不均匀,多为革兰阴性菌除去诱发因素,可以恢复成原菌作用于细胞壁的抗菌药物对其感染治疗无效细菌的结构

核

质细胞质：核糖体、质粒、胞质颗粒、中介体细胞膜细胞壁

荚膜鞭毛菌毛芽胞

基本结构特殊结构细菌的特殊结构－荚膜（capsule）某些细菌在其细胞壁外包绕一层粘液性物质，为多糖或多肽的多聚体，用理化方法去除后并不影响细胞的生命活动。功能抗吞噬作用粘附作用龋齿抗有害物质的损伤作用细菌的特殊结构－鞭毛（flagellum）成分为蛋白质具有抗原性鞭毛菌分成4类功能液体中能自由游动,

运动器官与致病性有关鉴定细菌和进行分类细菌的特殊结构－菌毛（pilus）许多革兰阴性菌和少数革兰阳性菌菌体表面存在着一种比鞭毛更细、更短而直硬的丝状物，与细菌的运动无关。蛋白质,菌毛蛋白有抗原性分类普通菌毛:数量多，短而细粘附结构，与致病有关性菌毛:少数革兰阴性菌,少粗、长、中空传递某些遗传物质菌毛（pilus）F+F-F+F-F+F+F+F+细菌的特殊结构－芽胞（spore）概念产生芽胞的都是革兰阳性菌芽胞的大小、形状、位置等随菌种而异细菌芽胞的形态芽胞形成芽胞

细胞分裂繁殖体周期子代细胞

强大的抵抗力

可在自然界中存在多年，是重要的传染源。芽胞并不直接引起疾病，只有发芽成为繁殖体后,才能迅速大量繁殖而致病。有重要的鉴别意义。芽胞是否被杀死作为判断灭菌效果的指标芽胞（spore）胞质颗粒核糖体菌毛拟核细胞壁细胞膜质粒鞭毛荚膜细菌结构总结第三节细菌形态检查法显微镜放大法细菌形体微小，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、电子显微镜）放大后才能观察。染色法细菌体小半透明，经染色后才能观察较清楚。显微镜放大法普通光学显微镜——普通光学显微镜的分辨率为

0.25um。一般细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察。

抗酸染色电子显微镜——电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形，内部超微结构可一览无余。肺炎链球菌荚膜荚膜显微镜放大法（二）细菌的染色应用：主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野显微镜检查不染色标本检查不染色标本检查-压滴法载玻片细菌悬液盖玻片染色标本的检查-常用染料碱性染料

电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。细菌的等电点在pH2~5之间，易与带正电荷的染料结合而着色。常用的染料有碱性复红、结晶紫、亚甲蓝等。酸性染料:电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。通常用来染细胞质，而很少用于细菌的染色。常用的染料有伊红、刚果红等。复合染料（中性染料）及荧光染料

复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料（伊红亚甲蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等；荧光染料如荧光标记的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。用于某些特殊的染色技术。脂溶性染料

如Sudanblack。染色标本的检查染色方法的种类单染法:采用一种染料染色复染法（鉴别染色）:采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使不同种类的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上不同的颜色，以便鉴别细菌。革兰氏染色图解革兰氏染色试剂

步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上

步骤2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上

步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层

步骤4：风干

步骤5：在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定步骤6：结晶紫染色1分钟

步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片

步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗

步骤9：酒精脱色至下滴液为无色，立即用蒸馏水冲洗

步骤10：番红复染1分钟，用蒸馏水轻轻冲洗

大肠杆菌（Escherichiacoli）革兰氏染色图

革兰氏染色阴性杆菌（红色）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）革兰氏染色

革兰氏染色阳性球菌（紫色）

注意事项1．革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。2．选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.干净的玻片、热固定、每一步水洗要彻底并且吸干等也是实验成功的关键。步骤：结果:

阳性菌——紫色

阴性菌——红色结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色复红复染涂片固定由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立。革兰染色法（GramStain）特殊染色荚膜染色特殊染色

负染色（墨汁染色）特殊染色

染色法革兰染色法在鉴别细菌、选择抗菌药物、研究细菌致病性等方面有意义

其他染色法单染色法、抗酸染色法、以及特殊染色法二、培养基的制备技术

培养基是指以液体、半固体或固体形式，包含天然或合成成分，用于促进微生物的繁殖或保持其活力的物质组成。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。（一）培养基的分类1、根据培养基的组成来源不同来区分:天然培养基;合成培养基;半合成培养基。天然培养基

天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料。如：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等

优点：营养成分丰富，培养效果好，来源广泛.缺点：成分难以确切知道。合成培养基合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。半合成培养基

在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。

这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。

固体培养基；液体培养基；半固体培养基。2、根据培养基的物理状态来区分液体培养基

所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。

固体培养基

在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。在实验室中，它被用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。

半固体培养基

把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.2～1%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。运输培养基；保存培养基；增菌培养基。3、根据培养基的用途来区分运输培养基

在取样后和实验室样品处理前的时间，保护和维持微生物活性的培养基（如Stuart或Amies运输培养基）。运输培养基中通常不允许包含使微生物增殖的物质，但是培养基应能保护菌株，确保它们不变质。保存培养基

用于在一定期限内保护和维持微生物活力，以防对微生物在长期保存中产生不利影响，或使微生物在长期保存后容易复苏的培养基（如Dorset卵黄培养基）。复苏培养基

能够使受损或应激的微生物修复，使微生物恢复正常生长能力，但不一定促进微生物繁殖的培养基。增菌培养基

大多为液体培养基，能够给微生物的繁殖提供较适当的生长环境，包括：

A.选择性增菌培养基：能够保证特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他菌体生长的培养基（如SC、LST、RV等）；

B.非选择性增菌培养基：能够保证大多数微生物生长的培养基（如M肉汤、营养肉汤）。分离培养基

支持微生物生长的固体或半固体培养基，包括：

A.选择性分离培养基：支持特定微生物的生长而抑制其他微生物生长的培养基（如PALCAM琼脂、TCBS、显色培养基等）；

B.非选择性分离培养基：对微生物没有选择性抑制的分离培养基（如脑心浸液肉汤、营养琼脂）。鉴别培养基

能够进行一项或多项微生物生理学和生化特性鉴定试验的培养基（如尿素培养基、Kligler琼脂等）；能够用于分离培养的鉴别培养基被称作分离/鉴别培养基（如XLD、DHL、TCBS等）。鉴定培养基

能够产生一个特定的鉴定反应而不需要做进一步确认实验的培养基（如ONPG、氧化酶试剂）。用于分离的鉴定培养基被称为分离/鉴定培养基（如显色培养基）。

显色培养基是在选择性培养基上加入了适量的带发色及荧光基团的酶底物，发色团（荧光团）与特殊酶可识别的基团相连。目标微生物产生一些特殊的可水解发色及荧光底物的酶，使得发色和荧光基团释放出来，从而使目标微生物带上易于辨别的特殊颜色或发出荧光。多用途培养基

同时具有多种不同用途的特定培养基。例如，血琼脂是一种复苏培养基，又是分离培养基，还可作为溶血实验的鉴别培养基。(1)即用型培养基：以即用形式置于容器中（如平皿、试管或其他容器）供应的培养基。(2)商品化脱水合成培养基：不立即使用的干粉形式的（如粉末、小颗粒、冻干等形式）培养基。溶于水后能制备成一种或两种类型的培养基：

a)完全即用型培养基：不需要添加其他成分的培养基；

b)不完全即用型培养基：使用时加入不稳定成分。4、

根据培养基的制备方法不同来区分5、

实验室制备个别成分培养基

实验室按照培养基配方逐一称取个别成分，按照培养基制备程序进行。二、培养基的制备正确制备培养基是微生物检验的一个基本步骤。在处理脱水培养基和其他含有有害物质（如胆盐或其他选择剂）的培养基时，应遵守良好实验室规范（GLP）和生产厂商的注意事项。使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制，如质量（体积）、pH、制备条件、灭菌条件、操作步骤等。当使用独立成分制备培养基时，按配方准确配制并记录所有配制步骤。另外，记录所有使用成分的特性（如代号和批号等）。（1）水

配制培养基应使用蒸馏水或相同质量的水，目的是排除抑制或影响微生物生长的物质。为保证蒸馏水的质量，蒸馏水的电阻率最少应达到0.3MΩ/cm。建议不使用未经过微生物含量检测的水（细菌总数应小于1000CFU/mL）。（2）称量和复水

称量所需的脱水培养基（注意缓慢操作，必要时佩戴口罩或在通风橱中操作，以防吸入含有有毒物质的培养基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后再加水至所需的量。（3）溶解和分装

脱水培养基加水后适当加热，并不停搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热前应先浸泡几分钟。由个别成分制备的培养基应将不同成分分别加入适量的水中，并充分溶解，然后再加水至所需的量。（4）pH的测定和调整用pH计测pH，必要时进行调整。在实验室用个别成分制备的培养基，除特殊说明外，培养基灭菌并冷却到25℃时，培养基的pH变化不应超过0.2个pH单位。一般使用大约浓度为40g/L（约1mol/L）氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L(约1mol/L)的盐酸溶液进行培养基pH的调整。值得注意的是，商品化的培养基在高压灭菌前后的pH可能变化很大，但使用质量好的蒸馏水或去离子水配制时，灭菌前并不需要调节pH。（4）分装

将配制好的培养基分装到适当的容器中，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内，分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。此外还须用防水纸包扎（目前试管一般多有用螺旋盖，采用金属或塑料试管帽），分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为恰当。每批培养基应另外分装20mL培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，作为测定该批培养基最终pH之用。培养基和试剂的灭菌通常采用湿热灭菌或过滤灭菌。但有些特殊培养基（如嗜盐琼脂培养基、MKTTn、科玛嘉弧菌显色培养基等）只能煮沸灭菌。煮沸后应迅速冷却，避光保存；明胶、血清、糖类等不耐高温的物质，应采取高压锅低温灭菌法（间歇灭菌法）灭菌；有些试剂不需灭菌，可以直接使用（参见相关国际标准或供应商使用说明）。所有培养基湿热或过滤灭菌后,必须进行监测,尤其是要对pH、颜色、无菌效果和均匀性等指标进行监测。（6）灭菌

制备含有有毒物质的添加成分（尤其是抗生素）时，需要特别小心（必要时在通风橱内操作），避免因粉末的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应。制备溶液时要特别小心并按产品使用说明操作，不要使用过期的试剂。对于抗生素工作溶液，应当现用现配。在特定环境下，抗生素溶液应适量分装后冷冻储存，但解冻后的溶液不能再次冷冻，生产厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的有关资料，也可由使用者自行测定。（7）添加成分的制备培养基的使用(1)琼脂培养基的融化将培养基放到沸水浴中或使用有相同效果的方法（如高压锅中的蒸汽）使之融化。经过高压的培养基尽量减少加热时间以保证培养基的质量。避免过度加热，培养基融化后即可将其从加热器上取下，放入47℃±2℃的恒温水浴锅中冷却，直至使用。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4h。(2)培养基的脱气必要时，将培养基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min，加热时松开容器的盖子；加热后盖紧盖子，迅速冷却至使用的温度。(3)添加成分的加入对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47℃±2℃时再加入。在加入灭菌的添加成分前，先放置到室温，避免冷的液态造成琼脂凝结或形成片状物。将加入培养基的所有添加物缓慢充分混匀，然后尽快分装到要使用的容器中。(4)培养基斜面和平板培养基的制备和储存琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55℃-60℃时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。制备平板培养基，将融化的培养基倾注到平皿中，使之在平皿中形成一个至少2mm厚的琼脂层（对于直径90mm的平皿，通常需要加入15mL琼脂培养基）。将平皿盖好盖子后放到一个凉的水平平面使琼脂冷却凝固。在培养过程中，培养基会损失水分，当水分损失的量大于培养基总量的15％时，就会影响微生物的生长。

凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）放在4℃～12℃冰箱的密封袋中，最多存放一周或按厂商提供的标准执行。在平板底部做好标记，标记的内容包括制备日期和（或）有效期和名称，也可以使用培养基的编码系统进行标记。将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了避免产生冷凝水，平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对琼脂培养基表面进行干燥处理。对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥；干燥时，将平板盖揭开，将平板倒扣于烘箱（培养箱）中（温度设为20℃～50℃），或放在有对流风的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥，商业化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明操作。(5)培养培养时每垛最多堆放6个平板，平板间要留有空隙以进行空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致。对于液体培养基，培养基温度与培养箱达到一致取决于很多因素，如体积、内容物量、容器类型、培养类型等。在使用厌氧罐时，有时堆放的平板数可以超过6个。(6)培养基的弃置所有污染的和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式，而且要符合国家和地方法规的规定。成品的质量控制

(1)物理质量的控制实验室测试至少应包括以下内容：20℃～25℃时的pH；

观察以下内容：加入培养基的量和（或）琼脂层的厚度；色泽；透明度和（或）是否存在肉眼可见的杂质；凝胶稳定性（粘稠度）和湿度。(2)微生物指标控制A.污染检测：在每批制备好的培养基选取部分样品进行污染测试。B.测试菌株：具有代表性的稳定特征并能有效证明实验室培养基最佳性能的一套菌株。测试菌株主要购于标准菌株保藏中心，也可以是实验室自己分离的具有良好特性的菌株。最好使用从事品种分离的菌株。包括：阳性菌株、阴性菌株等。C.即用培养基和试剂：应由商品化即用培养基的生产厂，向使用者提供相应的资质证明。使用者就不必对培养基进行大量的培养基测试工作，但应保证其储存条件。D.商品化合成脱水培养基制备的培养基：对于每批制备好的培养基，除用有效菌株进行测试外，还应用实际样品进行检测，以更好地证明。不含指示剂的培养基，只需用阳性测试菌株进行检测。含有指示剂或选择剂的培养基，应使用能证明其指示或选择作用的菌株进行试验。复合培养基（即需要加入添加成分的培养基）需要用具备有效性能的菌株逐批进行验证，对实验室制备的需加入添加成分的现成培养基同样适用。1.SN/T1538.1-2005培养基制定指南第一部分：实验室培养基制备质量保证通则。2.ISO/TS11133.1-2000食品和动物饲料的微生物学培养基制备和生产导则第1部分实验室培养基制备的质量保证一般导则3.SN/T1538.2-2007培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南。本部分标准规定了培养基的通用质量控制要求并列举了固体和液体培养基的性能测试方法。本部分标准适用于市售和自制培养基的性能测试。三、微生物的分离、纯化与接种技术接种工具和方法在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。

接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀

微生物的分离、纯化与接种技术划线接种：这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。划线接种，分离纯化Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies灼烧微生物的分离、纯化与接种技术斜面接种技术微生物的分离、纯化与接种技术

－－细菌的涂布分离技术微生物的分离、纯化与接种技术

－－液体接种法、穿刺接种液体接种法：包括从斜面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种，同时要求无菌操作。微生物的培养

－－微生物培养中的氧气条件培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵——摇床、厌氧培养罐等。好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用的方法。在进行厌氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实验室中常用的如葡萄糖——美兰指示剂。微生物的培养

－－微生物培养中的厌氧条件生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入发芽种子，因种子的呼吸作用增强，吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气。在容器的一边放一包用吸水紙包好的焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，两者反应时吸收容器中的氧气，创造厌氧条件。物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器内的空气或再充入其它惰性气体，以保证厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培养物。一般为达到严格厌氧目的，常采用物理和化学相结合并用的方法。微生物的培养

－－微生物培养中的厌氧培养美兰氧化还原指示剂：0.006NNaOH0.015%美兰溶液6％葡萄糖溶液上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，迅速放入厌氧罐中。微生物细胞大小和数量的测定目的要求：学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下测定微生物大小的方法；学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。实验材料：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、细菌染色片、血球记数板、酵母菌悬液、盖玻片、无菌滴管、西水纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯测定微生物的大小测定的工具：目镜测微尺镜台测微尺测定微生物的大小目镜测微尺的校正：在高倍镜下，看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺的0点与镜台测微尺的某一刻度重合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计算两刻度间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。由于镜台测微尺的刻度每格长10µm，所以可得：目镜测微尺每格长度（µm）=（镜台测微尺格数×10）/目镜测微尺格数

注意：校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的接物镜、接目镜、镜筒长度等）进行，而且只能在这特定的情况下才可重复使用。菌体大小的测定：取下镜台测微尺，将细菌染色标本置于载物台上，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的长和宽。测定微生物数量方法：活菌计数法——平板菌落计数法；总菌计数法——血球计数板或霍瑟（PeroffHausser）细菌计数板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。

测定微生物数量本实验用血球计数板计数酵母菌的数量取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。高倍镜下计数：随机计数五个中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。计算方法：注意事项：压在方格线上的菌体，以压在底线和右侧线上的菌体计入本格内；遇到有芽体的酵母时，若芽体和母体同等大，就按单个酵母计数。计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。（X1+X2+X3+X4+X5）5×25（或16）×10×1000×

稀释倍数酵母菌细胞数/mL=细菌生理学检查法

－－微生物保藏方法斜面冰箱保藏法：将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要长出孢子，贴上标签，放在试管架上，在棉塞部位用尼龙紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔3个月至半年用新鲜培养基移植1次。方法简便，实验室均采用。

缺点：移接代数太多，易产生变异、退化。石蜡封藏法：在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡油，高出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏，适用保存细菌和放线菌。石蜡的处理：250mL三角瓶装100mL液体石蜡，1.05kg/cm3高压灭菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸发掉。砂土管保藏法：(可用于保藏产孢子的放线菌、霉菌和产芽孢的细菌）。1.砂土管的制备：取河沙若干，用40目过筛，出去大颗粒，加10％HCl后煮沸30min，除去有机质（也可用10％HCl浸泡2—4h)。最后倒去酸水，用自来水冲洗至中性，烘干备用。另取0.3m以下非耕作层的瘦黄土若干，晒干磨细，过120目筛。2.按土：砂＝1：4的比例均匀混合，装入指形管中，以1cm高为宜，塞上棉塞，160～1700C干热灭菌2h。3.在新鲜菌种斜面上加入3mL左右的无菌水，用无菌接种环制成菌悬液，用无菌吸管吸取0.2～0.3mL的菌悬液放入每个砂土管中，用接种环拌匀，并贴上标签，注明菌名。4.菌液加好后，立即进行抽真空干燥，要求在24h内抽干，尤其是夏天要求较短时间内抽干。摇散砂土，放干燥器内冰箱保藏。冷冻真空干燥保藏法：此法一般常用于细菌或病毒一类的菌种保藏，常用脱脂牛奶或血清作为菌种的保护剂。§4接种、分离纯化4.1接种

将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

4.1.1接种工具1．接种针

2.接种环

3.接种钩

4.5.玻璃涂棒

6.接种圈

7.接种锄

8.小解剖刀

图4-1

接种和分离工具4.1.2无菌操作

培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。

平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。4.2接种法与纯培养的分离技术含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixedculture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pureculture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。

4.2.1平板划线分离培养法

平板划线分离培养法，用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线，使培养物中混在的多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌（纯培养）。分离细菌的方法很多，最常用的是平板划线分离法。根据划线的方式不同有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图4-2）

图4-2平板划线分离法

1.斜线法

2.曲线法

3.方格法

4.放射法

5.四格法

1.曲线划线分离法1)先将接种环火焰灭菌,待冷后取培养物少许;2)左手拿起平板，以中指为支点，并用拇指和食指将平板盖打开；3)右手迅速将取有培养物的接种环从打开的空间插入平板内，使接种环与培养基表面呈45℃角，在酒精灯上方5~6cm处划线接种。先在平板上1/5处轻轻涂布，然后即可左右来回以曲线形式作连续划线接种，线与线间留有适当距离，将整个平板表面划满曲线；4)注明标识后，置35℃培养箱中培养，一般在18~24小时后观察结果。2.斜线(分区)划线分离法1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线,再在2、3……区依次划线。2)每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域。3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1~2次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。斜线接种示意图3.方格划线法

将培养物涂布于平板上1/5处，接种环经火焰灭菌后，自1/5划线处作平行划线5~6条，将接种环灭菌后，划垂直线5~6条，使呈正方形格。其他操作同前。

细菌在固体培养基表面只能在固定的地方生长繁殖，经过一定的培养时间后，可形成肉眼可见的菌落。菌落中只含有一种细菌，而每种细菌的菌落各有其特征。菌落形态往往有助于初步识别细菌；还可以由此获得细菌而进行一系列的鉴定。

识别菌落的能力是从事微生物检验人员的极为重要的基本功。菌落形态观察1)大小:以mm表示。菌落的大小随细菌种类、培养基及培养时间等条件而不同。同一种细菌在同一平板上，在密集处的菌落比疏散处小。因此，表示菌落大小时，应注明培养基名称。一般以培养18~24小时后，选散在处的菌落大小。1mm左右为小菌落；2~3mm为中等大；3mm以上为大菌落。2)形状及边缘：圆形、不规则、放射状、树根状、边缘整齐、波形、锯齿状、卷发状等。3)隆起：平的、突起的、凸面的、凸形的等。4)表面：光滑（S型）、粗糙（R型）；有无光泽等。

图4-3细菌的培养特征1.点状2.圆形3.丝状4.不规则形5.假根状6.纺锤状7.扁平8.隆起9.凸起10.垫状11.脐状

12.边缘整齐13.波状14.裂片状15.啮蚀状16.丝状17.卷发状

18.丝线状19.刺毛状20.串珠状21.疏展状22.树根状23.假根状

24.丝状25.串珠状26.乳头状27.绒毛状28.树根状29.量杯状30.萝卜状31.漏斗状32.囊状33.层状34.絮状35.环状36.蹼状37.膜状5)构造:均匀、露滴状、颗粒状、发状、皱招状等。6)颜色：无色、白色、灰色、灰白色或乳白色、荧光绿、金黄色、柠檬