微生物的培养技术和应用 【备课精研+高效课堂】 高考生物一轮复习 （新教材新高考）

2023高考一轮复习第33讲微生物的培养技术和应用

讲考纲讲考情讲核心素养题型剖析考点梳理内容导航21微生物的培养技术及应用

微生物的选择培养和计数

1.最新考纲（1）微生物的分离和培养Ⅰ（2）某种微生物数量的测定Ⅱ（3）培养基对微生物的选择作用Ⅱ2.最近考情2022·全国甲卷(11)、2022·全国乙卷(11)、2022·广东卷(21)、2022·湖南卷(21)、2022·山东卷(14)、2021·山东卷(14)、2021·山东卷(20)、2020·山东卷(20)、2022·湖南卷(20)、2021·天津卷（1）、2021·北京卷（12）、2021·湖南卷（21）、2021·广东卷（21）、2020·全国卷Ⅰ（37）1.科学思维——分析与综合：分析培养基的种类、成分及其应用；

比较与分类：平板划线法和稀释涂布平板法原理、操

作及应用；选择培养基和鉴别培养基的配制原理及用途2.科学探究——设计实验：探究微生物分离的分离和纯化3.社会责任——关注实验室安全，建立科学合理的实验思维微生物的培养技术及应用考点11、微生物的概念

微生物是难以用肉眼看观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒、放线菌及一些原生生物等。一、微生物的培养无细胞结构原核细胞真核细胞微生物的种类RNA病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；放线菌：链霉菌等原生生物：衣藻、草履虫、变形虫等(低等的单细胞动物、植物）细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；（杆菌、球菌、弧菌、螺旋菌）真菌：酵母菌、霉菌（如毛霉）等；DNA病毒：噬菌体等2、研究和应用微生物的前提

防止杂菌污染，获得纯净的配生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的基础。3、实验室培养微生物的基本原则

一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；另一方面要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。二、培养基2、培养基的种类液体培养基：不含凝固剂（如琼脂）、呈液体状态的培养基固体培养基：呈固体状态的培养基（加入凝固剂，如琼脂）1、概念

人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。培养基的其他分类方法分类标准培养基种类培养基特点作用物理性质固体培养基液体培养基功能选择培养基鉴别培养基成分来源天然培养基合成培养基分类标准培养基种类培养基特点作用物理性质固体培养基加凝固剂，如琼脂微生物的分离与鉴定、活菌计数、保藏菌种液体培养基不加凝固剂常用于工业生产功能选择培养基在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长微生物的选择、分离鉴别培养基在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物微生物的鉴定成分来源天然培养基用化学成分不明确的天然物质配制常用于工业生产合成培养基用已知的化学物质配制微生物的分离、鉴定等★菌落：微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的，有一定形态结构的子细胞群体。3、培养基的营养组成

各种培养基的配方不同，一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。例如：牛肉膏蛋白胨培养基微生物乳酸杆菌霉菌细菌厌氧微生物特殊条件添加维生素pH调至酸性pH调至中性或弱碱性无氧组分含量提供的主要营养牛肉膏5g碳源、磷酸盐和维生素等蛋白胨10g氮涛和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1000ml水【思考】为什么培养基需要氮源?

培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。三、无菌技术1、获得纯净培养物的关键：防止杂菌污染。2、具体操作（1）消毒和灭菌：对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。（2）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。【思考】无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？

无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。3、消毒与灭菌消毒灭菌概念使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌适用对象操作空间、操作者的衣着和手等器皿、接种用具、培养基等注意：区别芽孢和孢子①某些细菌在其生长发育后期，可在细胞内形成一个圆形的抗逆性休眠体，称为芽孢。每个细菌细胞仅形成一个芽孢，故它无繁殖功能。芽孢有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压的能力。芽孢的休眠能力十分惊人，可保持几年到几十年的生活力。②孢子是微生物产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞。一般是单细胞，个体微小，通常是适应于从不利环境条件中存活下来，并在条件改变时产生新的营养体，能直接发育成新个体方法条件作用对象消毒煮沸消毒法100℃，煮沸5～6min杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。用于家庭餐具等生活用品的消毒巴氏消毒法62~65℃消毒30min或80~90℃处理30S~1min杀死牛奶中绝大多数微生物，并且基本不会破坏牛奶的营养成分。牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体方法条件作用对象消毒化学药物消毒法用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒；石炭酸、煤酚皂溶液；一定浓度的乳酸、食醋皮肤、伤口、动植物组织表面和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等紫外线消毒紫外线照射30min照射前，适量喷洒石炭酸、煤酚皂溶液等消毒液，可以增强消毒效果方法条件作用对象灭菌湿热灭菌利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌效果最好，100kPa、121℃维持15～30min培养基及多种器材、物品干热灭菌在干热灭菌箱内，160～170℃条件下，加热2～3h耐高温和需保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等方法条件作用对象灭菌灼烧灭菌直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速地灭菌微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等三、微生物的纯培养1、微生物纯培养的概念

在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。

由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。

获得纯培养物的过程就是纯培养。2、工具3、酵母菌的纯培养【探究·实践】（1）菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。（2）纯培养方法：平板划线法和稀释涂布平板法。（3）纯培养的原理：将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物(单菌落)。（4）酵母菌的纯培养步骤

微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、倒平板、接种、分离和培养等步骤。①制备培养基

配制培养基→灭菌→倒平板②接种和分离酵母菌

通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。③培养酵母菌

完成平板划线后，待菌液被培养基吸收。将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24～48h。★倒平板的操作①拔出锥形瓶的棉塞②将瓶口迅速通过火焰③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。★倒平板的操作Ⅰ、培养基灭菌后需要冷却至50℃左右时才能倒平板。若温度过高，则培养基凝固后皿盖上冷凝水过多，落入培养基造成污染；若温度过低，则培养基又会凝固。Ⅱ、将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。Ⅲ、培养基冷却凝固后，要将培养皿倒置的原因：防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。Ⅳ、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板应弃用，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。Ⅴ、整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。★平板划线法①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。②在火焰帝冷却接种环。同时，拔出装有酵母培养液的试管的棉塞。③将试管口通过火焰。④在火焰附近用的接种环蘸取一环菌液★平板划线法⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次划线与第一次的划线相连。★平板划线法*灼烧接种环后，要冷却后才能进行操作，以免温度太高杀死菌种。*第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细胞繁殖而来的菌落。*划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。*最后一次的划线不要与第一次的划线相连。【思考1】每次划线前灼烧接种环的目的是什么？第1次划线前灼烧的目的：杀死接种环上原有的微生物，防止外来微生物干扰。2~5次划线前灼烧的目的：杀死上次划线后残留在接种环上的菌种，使下次划线的菌种直接来自上次划线末端，使每次划线菌种数目减少，达到分离菌种的目的。接种结束后灼烧的目的：杀死接种环上残存的菌种，避免污染环境或感染操作者。【思考2】2~5次划线时菌种来源于哪里？上次划线末端【思考3】在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。【思考4】在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或无菌操作不规范。如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为1→2→3→4→5，下列说法正确的是A.操作前要将接种环用酒精消毒B.划线操作须在酒精灯火焰附近进行C.只有在5区才可以得到所需菌落D.在1、2、3、4、5区域中划线前后都不需要对接种环灭菌B微生物的选择培养和计数考点2一、选择培养基1、微生物的筛选实例

科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌（能在70～80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存），进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶，

这种酶目前已被广泛用于体外扩展DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。2、实验室中微生物的筛选原理

人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。3、选择培养基

允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。【思考·讨论】尿素[CO（NH2）2]尿素含氮量高，化学性质稳定,是现代农业生产中一种重要的氮肥。分解尿素的细菌能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3,NH3可作为细菌生长的氮源。NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物利用。1、如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？【答案】设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，在培养基上生长，可以将分解尿素的细菌分离出来。2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？【答案】这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。二、微生物的选择培养1、方法：采用稀释涂布平板法

土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。2、稀释涂布平板法的操作过程(1)系列梯度稀释操作每支试管及其中的9mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在火焰附近。(2)涂布平板操作①取菌液：取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。②涂布器灭菌：取出浸在酒精中的涂布器，放在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，冷却涂布器。③涂布过程：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀注意：不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。3、培养

待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中培养1-2天。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。三、微生物的数量测定1、稀释涂布平板法（统计样品中活菌数目）（1）原理

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。（2）操作要点①通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。（3）结果分析统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。2、显微镜直接计数

利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。

【探究·实践】土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

(1)土壤取样细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，据大多数分布在距地表约3～8cm的土壤层。取样时先铲去表层土。(2)样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105、1×106、倍稀释的稀释液进行拼版培养，可以扩大稀释范围，以保证获得菌落数在30～300的平板进行计数。(3)微生物的培养与观察①不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。②条件：30-37℃的恒温培养箱中培养1-2天③观察：每隔24h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。④记录菌落特征：形状、大小、颜色等（4）注意事项：1、避免依然酒精。2、无菌操作。3、做好标记：组别、日期、稀释度等。

【讨论】1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。【答案】如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？【提示】如果得到了两个或多个菌落数为30~300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？【提示】如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。【到社会中去】活菌计数技术广泛应用于食品卫生、水源污染度的检验和土壤含菌量的测定等方面。如果你感兴趣，可以从下列项目中选做一个，并走访相关部门或企业，了解它们是如何进行检测的。1.空气中微生物总数的检测；2.水中细菌总数的检测；3.牛奶中细菌的分离与计数；4.土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数。【与生物学有关的职业】发酵工程制药工

培养基可为微生物的生长、繁殖提供必需的营养物质。根据某些微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理设计培养基，可使其具有只允许特定的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。下列关于选