荧光分光光度法

荧光分光光度法课件第一页，共七十三页，2022年，8月28日（5）荧光的熄灭荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光熄灭。这些引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂。

第二页，共七十三页，2022年，8月28日导致荧光熄灭作用的主要类型:

（a）碰撞熄灭：碰撞熄灭是荧光熄灭的主要原因。它是指处于单重激发态的荧光分子M*与熄灭剂Q发生碰撞后，使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态，因而产生的熄灭作用。

第三页，共七十三页，2022年，8月28日碰撞熄灭的定量方程：F0/F-1=k[Q]

上式称为Stern-Volmer方程式。式中：k为熄灭常数；[Q]为熄灭剂浓度，单位mol/L；F0、F分别为熄灭剂不存在时和存在时，溶液的荧光强度。第四页，共七十三页，2022年，8月28日）k与体系的粘度有关系，粘度越大，k越小；）k与体系的温度有关系，温度升高，k也升高；温度每升高1C，k值增加在2%以下；）熄灭剂的浓度[Q]不得大于10mol/L。第五页，共七十三页，2022年，8月28日（b）组成化合物的熄灭有些荧光熄灭现象不能用碰撞熄灭理论来解释。

例如：某些荧光物质溶液在加入一些熄灭剂之后，（*）溶液的吸收光谱有了显著的改变，（*）溶液的荧光强度显著降低。（*）荧光强度随着温度的升高而增强。以上几种情况都是因为组成化合物熄灭所致。第六页，共七十三页，2022年，8月28日上述情况可能是：

络合

M（有荧光）+QMQ（无荧光）

分解T，MQM+Q（荧光增强）

第七页，共七十三页，2022年，8月28日（c）转入三重线态（级）的熄灭含溴化合物、碘化合物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物及某些杂环化合物，容易转入三重线级，溶液中绝大部分转入三重线级的分子在一般温度下不发光，它们将多余的能量消耗于它们与其它分子的碰撞之中，因而引起荧光熄灭。

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溶液中的溶解氧常对荧光产生熄灭作用。这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光物质分子相作用，促进形成顺磁性的三重态荧光分子，即加速系间窜跃所致。

实验证明：O2的熄灭作用，似乎是随溶剂的介电常数的减小而增加，所以O2在水溶液中熄灭作用较小，而在有机溶剂中熄灭作用较强。第九页，共七十三页，2022年，8月28日（d）发生电子转移反应的熄灭某些熄灭剂分子与荧光物质的分子相互作用时，发生了电子转移的反应，即氧化-还原反应，因而引起荧光的熄灭。例：甲基兰荧光溶液被Fe2+熄灭D*+Fe2+D-+Fe3+有荧光无荧光

第十页，共七十三页，2022年，8月28日

发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金属离子，I-，Br-，S2O32-等易于给出电子的阴离子对奎宁、罗丹明及荧光素钠等有机荧光物质也会发生熄灭作用。第十一页，共七十三页，2022年，8月28日（e）荧光物质的自熄灭荧光物质溶液的浓度大于1g/L时，常常发生自熄灭现象，所以液态纯物质的荧光一般都不强烈。此种熄灭的原因：）由于浓度大，分子碰撞几率大，因而引起能量损失大；）溶液浓度过高，物质分子发生二聚体乃至多聚体，而这些多聚体不发光。

第十二页，共七十三页，2022年，8月28日（6）光散射光散射常常关系到一个实验的灵敏度和再现性。实践中常遇到的光散射包括溶液的瑞利散射和拉曼散射、器壁的散射及胶粒的散射（丁铎尔散射）。

第十三页，共七十三页，2022年，8月28日

当物质分子吸收了频率较低的光能后，并不足使分子中的电子跃迁到电子的激发态，而只是上升到基态中较高的振动能级上去，若在10-15~10-12s返回到原能级，此时辐射出和激发光相同波长的光，称为瑞利散射。

第十四页，共七十三页，2022年，8月28日

若返回到较原能级稍高或稍低的振动能级上，辐射出较激发光稍长或稍短的光，称为拉曼散射。第十五页，共七十三页，2022年，8月28日（7）表面吸附在稀溶液中（<1g/mL），表面吸附尤为明显，特别是有机溶剂，此吸附更为厉害。溶质常常吸附在瓶子、吸管和吸收池等壁上。芳香族化合物易吸附，并且所用溶剂的极性越小，吸附就越大。在非极性溶剂中加一点极性溶剂，常常可以减少这种吸附损失。第十六页，共七十三页，2022年，8月28日3.4荧光分析的仪器、特点及注意事项１.

荧光的分析仪器第十七页，共七十三页，2022年，8月28日

由光源发出的光，经第一单色器（激发单色器）后，得到所需要的激发光波长。荧光物质被激发后，将向四面八方发射荧光，但为了消除入射光及散射光的影响，荧光的测定应在与激发光呈直角的方向上进行。仪器中的第二单色器称为荧光单色器。它的作用是消除溶液中可能共存的其它光线的干扰，以获得所需要的荧光。第十八页，共七十三页，2022年，8月28日(1)光源

光源应具有强度大，适用波长范围宽两个特点。常用光源有高压汞灯和氙弧灯。

高压汞灯常用在荧光计中，发射强度大而稳定，但不是连续光谱。高压汞灯的平均寿命均为1500~3000h，荧光分析中常用的是365nm、405nm和436nm三条谱线。

第十九页，共七十三页，2022年，8月28日氙弧灯（氙灯）是连续光源，发射光束强度大，可用于200~700nm波长范围。在200~400nm波段内，光谱强度几乎相等。但氙灯需要稳压电源以保证光源的稳定。第二十页，共七十三页，2022年，8月28日

此外，高功率连续可调染料激光光源是一种新型荧光激发光源。

激光光源的单色性好、强度大。脉冲激光的光照射时间短，并可避免感光物质的分解。

第二十一页，共七十三页，2022年，8月28日(2)滤光片和单色器在荧光计中，通常采用激发滤光片和荧光滤光片作为激发光束和荧光辐射的波长选择器。而大部分的荧光光度计中至少选用一个，而常常是用两个光栅单色器，且均带有可调狭缝，以供选择合适的通带。

第二十二页，共七十三页，2022年，8月28日

激发滤光片、激发单色器的作用是让所选择的激发光透过并照射于被测试样上；

荧光滤光片、发射单色器的作用是把激发光所发生的容器表面的散射光、瑞利散射光和拉曼光以及溶液中杂质荧光滤去，让荧光物质发出的荧光通过而照射到检测器上。

第二十三页，共七十三页，2022年，8月28日

分光荧光计的入射狭缝及出射狭缝是用以控制通过波长的谱带宽度及照射到测定试样上的光能强度的。测定的目的不同，可以选择不同的狭缝，以获得较好的测定结果。第二十四页，共七十三页，2022年，8月28日(3)试样池荧光分析用的试样池需要用低荧光材料制成。常用石英为材料。试样池的形状以散射光较小的方形为宜。有的荧光计附有恒温装置，便于控制温度。测定低温荧光时，在石英池外套上一个盛有液氮的石英真空瓶，以便降低温度。第二十五页，共七十三页，2022年，8月28日(4)检测器荧光的强度比较弱，因此要求检测器有较高的灵敏度。在荧光计中常用光电池或光电管检测。但在荧光分光光度计中常用光电倍增管检测。二极管阵列和电荷转移检测器也应用于荧光光度计，它们可以迅速地记录激发和发射光谱，特别适用于与色谱法或电泳法的联用技术上。此外，可以记录二维荧光光谱图。第二十六页，共七十三页，2022年，8月28日

目前，设计的许多荧光光度计具有不少新的功能。采用双光束荧光分析装置，可以提高方法的精度；采用凹面全息光栅的大孔径异面光学系统，可减少杂散光的影响，并使检测限达5pg/mL；第二十七页，共七十三页，2022年，8月28日采用“区分器”装置，可以识别暗电流而不予记录，以减少荧光信号的噪音等。不少仪器中还配有累加、微分、偏振、流动注射和液相色谱联用装置等，大大扩展了荧光分析的应用范围。第二十八页，共七十三页，2022年，8月28日

光学纤维可在远离光源和检测器不同的区域中，进行几种荧光物质的分析。它是通过光学纤维将激发光源发出的辐射传输到待测试样，然后由同样的光学纤维将发射的荧光传输返回到检测器，进行测定。第二十九页，共七十三页，2022年，8月28日2.荧光分析的特点及注意事项(1)荧光分析的特点a.灵敏度高

分子荧光法的灵敏度通常比分子吸收光谱法高几个数量级（测定下限为:0.1~0.001g/g）。第三十页，共七十三页，2022年，8月28日这是因为在荧光分析中，可以采用高强度的光源和高灵敏度的荧光检测系统，从而大大地提高了它的分析灵敏度。而在分子吸收光谱法中，由于是测量入射光和透射光的比率，因而采取提高光源强度的办法不能提高分析灵敏度。第三十一页，共七十三页，2022年，8月28日b.干扰少

由于多种分子在紫外-可见光区都能产生吸收，但是其中只有一部分分子能再发射荧光，因此分子荧光法的固有干扰少。c.选择性强

因为荧光法不但可依据其特征发射（发射光谱），而且可以依据其特征吸收（激发光谱）来鉴定物质；而分光光度法只能根据被测物的特征吸收谱来鉴定。第三十二页，共七十三页，2022年，8月28日d.试样量少且方法简便

使用荧光微池用10L试液即可。e.能同时提供较多的物理参数

包括激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光总量、极值峰位、谱带宽度、量子产率、荧光寿命和荧光偏振等参数。第三十三页，共七十三页，2022年，8月28日(2)注意事项a.溶剂和化学试剂

对于溶剂，一是选择要适当，二是要足够纯。在使用波段范围内，选用的溶剂应无吸收才好；另外溶剂中也不应含有卤素、硝基化合物或重金属离子，否则会降低荧光强度。对于化学试剂，越纯越好。第三十四页，共七十三页，2022年，8月28日b.荧光的污染

荧光的污染源很多（如：活塞的润滑油、橡皮塞和软木塞、去污粉、洗液、滤纸和微生物等）。试验器皿须用1:1HNO3浸泡24小时或煮沸，再用蒸馏水洗净，凉干备用。第三十五页，共七十三页，2022年，8月28日3.5荧光分析的实验技术1.荧光计的校正(1)灵敏度的校正

荧光计的灵敏度可用被测出的最低信号来表示；或用某一标准荧光物质的稀溶液在一定激发波长照射下，能发射出最低信噪比时荧光物质的最低浓度来表示。第三十六页，共七十三页，2022年，8月28日

荧光分光光度计的灵敏度与三方面有关：（a）与仪器光源强度、单色器（包括透镜、反射镜等）的性能、放大系统的特征和光电倍增管的灵敏度有关；（b）与所选用的波长及狭缝宽度有关；（c）与空白溶剂的拉曼散射光、激发光和杂质荧光有关。第三十七页，共七十三页，2022年，8月28日

由于影响荧光计灵敏度的因素很多，同一型号的仪器，甚至同一台仪器，在不同时间操作所测得的结果也不尽相同。因而在每次测定时，在选定波长及狭缝宽度的条件下，先用一种稳定的荧光物质，配成浓度一致的标准溶液进行校正（或称：标定），使每次所测得的荧光强度调节到相同的数值（50%或100%）。如果被测物质所产生的荧光很稳定，自身就可作为标准溶液。第三十八页，共七十三页，2022年，8月28日

从紫外区到可见区常用的标准荧光物质有：酚（溶于甲醇）、吲哚（溶于乙醇）、奎宁（溶于0.05mol/L的H2SO4溶液）及荧光素（溶于水或乙醇）等。最常用的是硫酸奎宁，其产生的荧光十分稳定。第三十九页，共七十三页，2022年，8月28日(2)

波长校正

荧光分光光度计的波长刻度在出厂前一般都经过校正，但若仪器的光学系统和检测器有所变动，或在较长时间使用后，或在重要部件更换之后，有必要用汞弧灯的标准谱线对单色器的波长刻度重新校正，特别在精细分析工作中尤为重要。第四十页，共七十三页，2022年，8月28日(3)

激发光谱和荧光光谱校正

用荧光分光光度计测得的激发光谱或荧光光谱，往往是表观的，不是真实的。其原因很多：单色器波长刻度不够准确；拉曼散射光的影响以及狭缝宽度较大等，但这些因素都可消除或得到校正。最主要的是光源的强度随波长而变，检测器的响应与波长不成线性。第四十一页，共七十三页，2022年，8月28日

当用单光束荧光分光光度计测定激发光谱和荧光光谱时，因为不用参比溶液作相对校正，影响特别大。尤其是当峰的波长处在检测器灵敏度曲线的陡坡时，误差最显著。

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因此，先将每一波长的光源强度调整到一致（用仪器附有的校正设备），然后根据表观光谱上每一波长的强度除以检测器对每一波长的响应强度进行校正，以消除这种误差。校正的方法常由于仪器不同而不完全相同。

目前生产的荧光分光光度计大多采用双光束光路，可用参比光束抵消光学误差。第四十三页，共七十三页，2022年，8月28日2.实验新技术(1)时间分辨技术

时间分辨发光光谱技术是基于不同发光体的发光衰减速率的不同，配置使用带时间延迟设备的脉冲光源（闪光灯或激光器）和带有门控时间电路的检测器件（见下图），通过选定延迟时间td和门控时间tg，对发射单色器进行扫描，得到时间分辨发射光谱，从而实现对光谱重叠但发光寿命不同的组分进行分辨和分别测定。第四十四页，共七十三页，2022年，8月28日

或者固定激发与发射波长，对门控时间扫描，得到发光强度随时间的衰减曲线，从而实现发光寿命的测量。时间分辨技术还能利用不同发光体形成速率的不同进行选择性测定。第四十五页，共七十三页，2022年，8月28日(2)偏振和各向异性技术

在偏振光激发下，荧光体所发射的荧光在空间取向强度不同，即偏振光。荧光偏振和各向异性测定，即只需在荧光分光光度计的激发和发射光路上分别加上起偏器和检偏器（统称偏振附件）。

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在处的荧光偏振P()和各向异性r()值可按如下公式计算：P()=[III()-GI()]/[III()+GI()]r()=[III()-GI()]/[III()+2GI()]

式中：III()和I()分别是检测器的取向平行和垂直于起偏器取向时在波长处观察到的荧光强度，G为校正因子，可实验测定。第四十七页，共七十三页，2022年，8月28日

由于荧光偏振不仅与荧光体分子形状、光选择性和荧光体吸光对偏振激发的取向等内在因素有关，而且许多外界因素，如：环境的粘度等都会影响和改变其偏振度，从而在生化领域中获得了广泛的应用。

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荧光体的偏振度与荧光体的转动速度成反比这一特性，可用于荧光免疫分析。若采用脉冲偏振光激发荧光体，还可以进行荧光偏振及各向异性的时间分辨测量。第四十九页，共七十三页，2022年，8月28日（3）同步扫描技术

根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描技术可分为：固定波长差、固定能量差和可变角（可变波长）同步扫描。

第五十页，共七十三页，2022年，8月28日同步扫描技术具有使光谱简化，谱带窄化，提高分辨率，减少光谱重叠，提高选择性和减少散射光影响等诸多优点。这种光谱简化，虽然损失了其它光谱带所包含的信息，对光谱学的研究不利，但是对分析工作却十分有利，可以避免其它谱带存在所引起的干扰，提高测量的选择性。

第五十一页，共七十三页，2022年，8月28日固定波长差同步扫描中，波长差的选择直接影响到同步光谱的形状、带宽和信号强度，从而提供了一种提高选择性的途径。

目前，有关合适Δ的选择已有若干理论研究，但在实际应用中多根据具体的发光体系通过实验加以选择。第五十二页，共七十三页，2022年，8月28日固定能量差（Δ）同步扫描可能克服0-0带跃迁非常弱甚至不显现的情况，以及不同组分对Δ的不同要求所带来的困难。有可能对同一类化合物（如：多环芳烃）只选择一个Δ值用于整个光谱的扫描。同时还能最大限度地减小瑞利散射和拉曼散射的干扰。

第五十三页，共七十三页，2022年，8月28日可变角同步扫描技术可进一步提高测量的选择性。第五十四页，共七十三页，2022年，8月28日同步荧光分析方法的应用:

固定波长差同步荧光分析多环芳烃和生物大分子的检测小分子与蛋白相互作用的热力学研究固定能量差同步荧光分析多环芳烃的检测第五十五页，共七十三页，2022年，8月28日可变角同步荧光分析天然产物检测高背景体系中微量组分的检测第五十六页，共七十三页，2022年，8月28日(4)

三维光谱

三维荧光光谱（亦称：总发光光谱或激发-发射矩阵图）技术与常规荧光分析的主要区别是能获得激发波长和发射波长同时变化时的荧光强度信息。三维荧光光谱有两种表示形式：等（强度）高线图（如下图中带圈的部分）和等角三维投影图。

等高线图易于获得更多的信息和体现与常规荧光光谱和同步光谱的关系。

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三维光谱技术能获得完整的光谱信息，是一种很有价值的光谱指纹技术。可在石油勘采中用于油气显示和矿源判定；在环境检测和法庭判证中用于类似可疑物的鉴别；临床医学中用于癌细胞的辅助诊断和不同细菌的表征和鉴别；另外，作为一种快速检测技术，对化学反应的多组分动力学研究具有独特的优点。第五十八页，共七十三页，2022年，8月28日3.6荧光分析的用途分子荧光分析，是测量试样溶液在光源辐射激发下产生的荧光光谱及荧光强度，从而鉴别待测物质和测定其含量的一种分子光谱分析方法，它实际上是一种利用光能激发的分子发射光谱分析法。它在实际应用中主要用于微量物质的定量分析。

第五十九页，共七十三页，2022年，8月28日荧光法作为一种高灵敏度的分析手段，被广泛地应用于各个领域。可用荧光法测定的元素达70多种，可用荧光法测定的有机化合物为数更多，至少在数百种以上。第六十页，共七十三页，2022年，8月28日1.无机化合物的荧光分析能发生分子荧光的无机物很少，因此一些无机元素需与某些有机试剂生成荧光络合物后进行间接测定。较常采用荧光法测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg及某些稀土元素等。可测量约60多种元素，测定的方法可以分为以下四种：第六十一页，共七十三页，2022年，8月28日(1)荧光熄灭法：一些元素可用荧光熄灭法进行测定，这些元素的离子从发生荧光的其它金属—有机试剂络合物中夺取该有机试剂或金属离子以组成更稳定的络合物或难溶化合物，从而导致荧光强度的降低，由荧光强度降低的程度来测定该元素的含量。用该法测定的元素有：F、Cl、S、Fe、Ag、Co和Ni等。第六十二页，共七十三页，2022年，8月28日(2)催化荧光法：某些荧光反应进行非常缓慢，荧光微弱，难于测定，但若有微量金属离子存在，可起催化作用，反应将大大加速，可由在给定时间内所测定的荧光强度来定量该起催化作用的金属离子，称为催化荧光法。用该法测定的元素有Cu、Be、Fe、Co、Os及H2O2等，该方法灵敏度特高，有的可达0.1ng/g。第六十三页，共七十三页，2022年，8月28日(3)低温荧光法：测定的元素有Cr、Nb、U、Te等（-196C液氮温度下）。(4)固体表面荧光分析法（SFF)：是将待测组分吸附于固体物质表面上，然后进行荧光测定；测定的元素有U、Ce、Sm、Eu、Tb、稀土元素及Sb、V等。第六十四页，共七十三页，2022年，8月28日2.有机化合物的荧光分析

在有机化合物中，脂肪族化合物的分子结构较简单，能产生荧光的为数不多。芳香族化合物因有共轭的不饱和体系，容易吸收光能，其中结构庞大而复杂的化合物，在光照射下大多能产生荧光。并且采用某些有机试剂与弱荧光的芳香族化合物作用，可得到很强的荧光物质。第六十五页，共七十三页，202