PCR技术分离目的基因课件

第二节PCR技术分离目的基因一PCR技术

1PCR的含义

PCR（polymerasechainreaction）：模仿细胞内发生的DNA复制过程，体外大量合成目的DNA片段，包括变性、退火、延伸三个步骤。2PCR反应程序：（1）90－95℃模板变性（2）37－60℃引物与模板复性（退火）（3）70－75℃引物，合成模板链DNA的互补链循环25-35次加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。

引物引物Mullis’ideaDNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术PCR引物的设计原则:1.引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp。3.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

5.引物自身

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

6.引物之间

两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

ＲＴ－ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增RACE（RapidamplificationofcDNAends）cDNA末端的快速扩增技术，是以mRNA为模板合成cDNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3’或5’端之间未知序列的方法。3’-RACE5’-RACE目的基因的分离技术：基因文库技术PCR技术插入突变法分离目的基因图位克隆法分离目的基因（chromosomewalking）

酵母双杂交技术分离目的基因

基因芯片技术蛋白质组学技术....第三节基因的化学合成在基因的化学合成中，首先要合成出有一定长度的、具有特定序列结构的寡核苷酸片段，然后再通过DNA连接酶的作用，使它们按照一定的顺序共价地连接起来。目前已发展出来的有关寡核苷酸片段的化学合成方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，以及在后二者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。磷酸二酯法（最早创立的DNA化学合成方法）基本原理：将两个在5’或3’—末端各带有适当保护基团的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个两端都被保护的二核苷酸