2015级检验基础病毒的检查方法

第二十四章

病毒感染的检查方法

与防治原则

检测内容查病毒查特异性抗体

病毒颗粒病毒抗原病毒核酸病毒酶类：如逆转录酶

电镜直接观察光镜检查包涵体分离培养第一节病毒感染的检查方法一、标本的采集、处理与运送

力争早期无菌标本选择：根据临床症状和流行病学资料分析，初步判断可能是哪类疾病，再根据感染部位和病程决定采集何种标本：从病毒侵入部位取材从感染靶器官取材多部位取材可选用的标本：渗出液、分泌物、组织、各种体液、粪便和各种拭子等。带有杂菌的标本用于病毒分离培养可用抗生素或抗真菌药物处理。冷藏保存，快速送检。用于病毒分离的标本应注意低温保存。长时间保存加入甘油或二甲基亚砜-70℃冻存。检测抗体的动态变化应取早期和恢复期双份血清，-20℃冻存，同时检测。单份血清检测IgM可用于早期诊断。

常见分离病毒标本的选择

病毒咽拭子粪便血液脑脊液唾液

组织

肠道病毒

+++心

疱疹病毒

+脑膜

腮腺炎病毒

+++流感病毒

+轮状病毒

+HAV、HEV+HBV、HCV、HDV+HIV+精液二、病毒的分离与鉴定金标准，但适用于实验室研究或流行病学调查，用于下述情况：疾病病原学鉴别诊断发现新病毒或再发性病毒疾病对治疗疾病有指导意义监测病毒活疫苗效果（及时发现毒力回复株）流行病学调查病毒生物学性状的研究（一）标本的前处理

处理目的：去除标本中的陈渣、细菌、真菌和毒性物质，释放组织、细胞中的病毒。无菌收集的体液可直接接种。处理过程繁杂，每种标本有不同处理方法。（二）一般程序

（三）病毒的分离培养

细胞培养（cell

culture）

鸡胚接种（egginoculation）

动物接种（animalinoculation）1.动物接种应用：尚无敏感细胞的病毒培养观察指标：动物是否发病动物：兔、鼠、黑猩猩、猴等优点：结果易观察，可建立动物模型缺点：有饲养条件要求，费用高，动物

体内常带有潜伏病毒2.鸡胚培养采用孵化9～14天的鸡胚

绒毛尿囊膜（allantocherion）痘苗病毒、人类疱疹病毒尿囊腔（allantoiccavity）接种部位流感病毒、腮腺炎病毒羊膜腔（amnioticcavity）流感病毒的初次分离卵黄囊（yolksac）嗜神经病毒优点：易管理，不带微生物，成本较低缺点：操作程序复杂

3.细胞培养

单层细胞培养（monolayercellculture分类

悬浮细胞培养（suspendedcellculture）

原代细胞（primarycell）细胞种类

二倍体细胞（diploidcell）

传代细胞系（continuouscellline）(1)原代和次代细胞培养组织组织块分散的单个细胞单层细胞

剪碎

培养基(原代细胞)单层细胞(次代细胞)传代培养蛋白酶

特点：①对多种病毒敏感②生长能力有限,获取成本高③可携带潜伏病毒(2)二倍体细胞

体外分裂50～100代仍保持二倍体染色体数目，可用于病毒分离和疫苗生产。特点：①对多种病毒敏感②不带病毒，无致瘤潜能(3)传代细胞培养特点：①对多种病毒敏感性高②繁殖能力高，传代时间长③有致癌危险，不能用于疫苗生产来于肿瘤细胞，或由二倍体细胞突变而来。病毒在培养细胞中增殖的指标：细胞病变红细胞吸附干扰现象细胞代谢改变

(1)细胞病变效应（cytopathiceffect,

CPE）部分病毒在敏感细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细胞病变效应。

常见的细胞病变：①细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等（多数病毒）；②形成多核巨细胞或称融合细胞（麻疹病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒等）；③在培养细胞中形成包涵体（狂犬病病毒、麻疹病毒等）。麻疹病毒感染细胞呼吸道合胞病毒感染细胞②形成多核巨细胞或称融合细胞（2）红细胞吸附及吸附抑制试验正粘病毒、副粘病毒等感染的细胞膜上产生血凝素，使之能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。可被相应的病毒特异性抗体抑制，称红细胞吸附抑制试验。腮腺炎病毒感染细胞病毒囊膜表面血凝素(HA)＋红细胞表面HA受体(3)干扰现象（interference）风疹病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE(－)埃可病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE(＋)＋人胚肾细胞风疹病毒？埃可病毒CPE(-)—风疹病毒(+)

埃可病毒(-)CPE(+)—风疹病毒(-)

埃可病毒(+)(4)细胞代谢改变

细胞代谢变慢、pH变化减慢（四）病毒的鉴定

病毒形态学鉴定：电镜病毒血清学鉴定：鉴定病毒种、型、亚型血凝抑制试验、免疫标记法（FIA、EIA、RIA）病毒分子生物学鉴定：核酸扩增、核酸杂交、基因芯片、基因测序新病毒需进一步鉴定核酸类型的测定：DNA酶或RNA酶，5—溴-2-脱氧尿苷(BUDR)抑制DNA病毒复制理化性状的检测：大小、结构等基因测序和生物对比（五）病毒数量与感染性测定1、ID50/TCID50（50%tissuecellinfectiousdose）50%感染量或组织细胞感染量：测定病毒能使50%的动物或组织培养细胞发生感染的最小量，可估计病毒感染性的强弱及含量。2、蚀斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）：将噬菌体或病毒按一定倍数稀释，接种细菌或单层细胞，通过蚀斑计数，检测一定体积内噬菌体或病毒的量。空斑是指病毒增殖使感染的单层细胞病变脱落，形成肉眼可见的空斑。一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起的。可进行病毒颗粒的计数、病毒的鉴定和测定抗病毒药物的作用。3.红细胞凝集试验

病毒鸡胚培养液或细胞培养液＋鸡红细胞＝凝集（血凝试验）

将病毒悬液作不同稀释度，以血凝反应的最高稀释度作为血凝效价，可定量检测病毒颗粒的含量。（一）形态学检查电镜：直接观察负染色法超薄切片法免疫电镜检查普通光学显微镜：观察病毒包涵体三、病毒感染的诊断（二）病毒成分检测1.病毒蛋白抗原检测

免疫标记技术：酶免疫、免疫荧光

蛋白印迹技术2.病毒核酸检测

核酸扩增技术

核酸杂交技术

基因芯片技术

基因测序病毒核酸直接检测基本原理：已知序列的核酸单链作为探针，探针预先标记，一定条件下探针与待检核酸互补形成标记的核酸双链，利用放射自显影或其他方法示踪，检测结果。核酸杂交技术斑点杂交法：将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上，变性后，用标记的核酸探针进行杂交。

原位分子杂交技术：在细胞原位暴露DNA或RNA，加入标记特异核酸探针进行杂交。Southern印迹：用于DNA的杂交。提取DNA,电泳后移至硝酸纤维膜上，用标记探针进行杂交。Northern印迹：用于RNA杂交分析。1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖核酸扩增技术聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)

基本原理是依据细胞中DNA半保留复制机理，DNA在不同温度下变性、复性的特性，人为控制温度——高温变性、低温复性、适温延伸，循环多次后，可使目的基因得到扩增。以待扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补配对的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这一过程（变性、退火、延伸），即可使目的DNA片段得到扩增。1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍引物设计:特异保守片段作为靶基因诊断病毒性感染。病毒基因的易变区，结合RFLP，测序等技术对病毒进行分型和突变的研究。方法：巢式PCR、半巢式PCR、RT-PCR、多重PCR、原位PCR、实时荧光定量PCR（real-timePCR)、RNA捕获PCR、免疫PCR病毒核酸的直接检测提病毒核酸，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或琼脂糖凝胶电泳进行检测。

芯片是由固定于不同种类支持介质上的高密度的寡核苷酸分子、基因片段或多肽分子的微阵列组成，其中每个分子的位置及序列为已知，当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后，可通过激光共聚焦荧光扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对荧光信号的强度进行检测，计算机自动分析处理数据并报告结果。基因芯片技术(genechip)

基因芯片的基本原理（三）病毒感染血清学诊断检测抗体，不能早期诊断，用于以下情况：①采取标本分离病毒为时已晚②目前尚无分离此病毒的方法或难以分离的病毒③为证实所分离的病毒的临床意义④进行血清流行病学调查等检测双份血清诊断急性感染人群免疫情况调查检测特异性IgM作早期诊断检测早期抗原抗体常用方法：中和试验(neutralizingtest，NTtest)补体结合试验(complementfixationtest，CFtest)血凝抑制试验(hemagglutlnatiainhibitiontest，HItest)凝胶免疫扩散试验免疫荧光酶免疫放射免疫四、诊断方法选择的原则首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒。然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验诊断方法。1.对潜伏期短，发病时尚无抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。2.对潜伏期超过十天的感染，可检测特异性的IgM抗体来进行早期快速诊断，及区别初次和再次感染。3.对可在体内形成持续感染或潜伏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG抗体有无4倍以上升高，或直接检测病毒核酸。4.对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离的病毒为病原体。5.对同一症状可有多种病毒引起的情况，应同时检测几种相关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体。6.对由多个型别组成的病毒可测定它们的共同抗原。第二节感染病的特异性预防人工免疫(artificialimmunization)：

给机体注射或服用病原微生物抗原(包括类毒素)或特异性抗体以达到预防和治疗感染性疾病的目的。人工主动免疫(artificialactiveimmunization)

人工被动免疫(artificialpassiveimmunization)

一、人工主动免疫

(artificialactiveimmunization)

人工主动免疫是将疫苗及类毒素接种于人体，使机体主动产生获得性免疫力的一种防治微生物感染的措施，主要用于预防。特点:发生作用慢;持续时间长，接种次数少等。用于人工自动免疫的主要生物制品：死疫苗活疫苗类毒素亚单位疫苗基因工程疫苗重组载体疫苗核酸疫苗传统疫苗新型疫苗(一)疫苗

死疫苗(killedvaccine):

用物理、化学方法杀死病原微生物，但仍保持其抗原性的一种生物制剂。特点：多次接种，剂量较大，副作用大；不能刺激特异性CTL细胞产生，通常只激发体液免疫应答。但具有生产方法简单易保存等优点。活疫苗(livingvaccine)

亦称减毒疫苗(attenuatedvaccine):通过毒力变异或人工选择法而获得的减毒或无毒株，或从自然界直接选择出来的弱毒或无毒株经培养后制成的疫苗。特点:一次接种；剂量少；免疫效果好（体液/细胞），副作用小。免疫力持久。不便于储存、运输；潜在危险，免疫缺陷个体可发生疫苗株感染。区别点死疫苗活疫苗制剂特点死，仍保持免疫原性减毒或无毒株制备方法通过物理或化学方法使病原体失活通过非正常培养获得减毒株接种剂量与次数量较大，2~3次量较小，1次接种反应不增殖，可出现发热、全身或局部肿痛等反应增殖，类似轻型或隐性感染免疫应答体液免疫，0.5~1年体液/细胞免疫，维持1~5年或更长毒力回升及安全性不可能，安全性好有可能，对免疫缺陷者有危险保存及稳定性易保存，约1年，相对稳定不易保存，4℃数周。相对不稳定死疫苗和活疫苗的比较亚单位疫苗(subunitvaccine)

：去除病原体中与激发保护性免疫无关或有害的成分，但保留有效免疫原成分，能诱发机体产生免疫应答的疫苗。基因工程疫苗（geneengineeredvaccine):

利用基因工程方法或分子克隆技术将编码病原体保护性抗原表位的目的基因导入原核或真核表达系统中表达、纯化后制成的疫苗。重组载体疫苗(binantcarriervaccine)：将编码某一蛋白抗原的基因转入减毒的病毒或细菌而制成的疫苗。是活疫苗的一种特殊形式。核酸疫苗（nucleicacidvaccine):即DNA疫苗，将编码保护性抗原的基因重组到质粒真核表达载体上,直接注射或粘膜免疫导入宿主体内，外源基因在体内所表达的抗原刺激机体产生免疫应答。优点：免疫效果好；全面免疫应答；免疫力持久；制备简单、易储存；可用于预防和治疗。适于病毒或胞内寄生菌。缺点：安全性；表达调控。（二）类毒素外毒素经0.3%～0.4%甲醛处理后，失去了毒性仍保持免疫原性的生物制品。二、人工被动免疫(artificialpassiveimmunization)：

输人含有特异性抗体的免疫血清、纯化免疫球蛋白抗体等免疫制剂，使机体立即获得特异性免疫力的过程。可用于某些急性传染病的应急性预防和治疗。

特点:作用快，维持时间较短。

抗毒素抗血清丙种球蛋白、胎盘球蛋白免疫细胞、免疫分子人工被动免疫制剂区别点人工主动免疫人工被动免疫免疫物质抗原抗体或细胞因子等接种次数1~3次1次免疫出现时间慢（注射后2~4周）快（注射后立即出现）免疫维持时间长（数月~数年）短（2~3周）用途多用于预防多用于治疗或紧急预防两种人工免疫方法比较第三节病毒感染的治疗

核苷类药物

非核苷类反转录酶抑制剂

蛋白酶抑制剂其他抗病毒药物干扰素和干扰素诱生剂中草药新抗生素类：某些真菌、放线菌抗生素治疗性疫苗：DNA疫苗和抗原抗体复合物疫苗治疗性抗体基因治疗剂

抗病毒化学制剂反义寡核苷酸干扰RNA核酶（ribozyme）疱疹净（idoxurid