基因工程技术简要介绍

基因工程技术简要介绍第一页，共二十二页，2022年，8月28日基因工程的操作流程第二页，共二十二页，2022年，8月28日

将外源基因（又称目的基因，是一段

DNA片断）组合到载体DNA

分子中去，再把它转到受体细胞（亦称寄主细胞）中去，使外源基因在寄主细胞中增值和表达，从而得到期望的由这个外源基因所编码的蛋白质。第三页，共二十二页，2022年，8月28日所以，基因工程的操作包含以下步骤：

获得目的基因

构造重组DNA分子

转化或转染

表达

蛋白质产物的分离纯化第四页，共二十二页，2022年，8月28日

到哪里去找目的基因？

从组织细胞中可以分离得到人/小鼠的全套基因，称为基因文库。文库中基因总数就人来说约有3万个基因。如何从中把需要的基因找出来？采取“钓”的办法。这个办法通常称为印迹法。（1）获得目的基因第五页，共二十二页，2022年，8月28日印迹法内切酶切开DNA电泳印迹转移放射性探针杂交胶片显影第六页，共二十二页，2022年，8月28日印迹法的主要步骤：

（1）基因文库－DNA用限制性内切

酶处理。

（2）DNA片断混合物通过电泳分离。

（3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰

纤维薄膜上，以便操作。

（4）用已知小片断DNA作为探针，

互补结合需要找的基因片断。

（5）探针DNA片断已用放射性元素

标记，使胶片感光后可看出。第七页，共二十二页，2022年，8月28日印迹法的关键是“分子杂交”，利用碱基配对的原则，用一段小的已知的DNA片断去寻找（“钓”）大的未知的基因片断。

探针DNA片断从何而来？

根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中N－端15-20个氨基酸序列，按三联密码转为40-60核苷酸序列，人工合成，即为探针DNA片断。第八页，共二十二页，2022年，8月28日（2）目的基因的扩增用上面的方法“钓”出的目的基因，数量极少，所以，接下来必须经过扩增，亦称为基因克隆。获得相当数量的目的基因后，才能继续下一步操作。第九页，共二十二页，2022年，8月28日（3）PCR——把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。

PCR法，又称多聚酶链式反应，是近年来开发出来的基因工程新技术，它的最大优点是把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里完成。第十页，共二十二页，2022年，8月28日PCR操作流程90

0C500C700C返回第十一页，共二十二页，2022年，8月28日PCR反应分三步完成：

第一步——90

0C高温下，使混合物的DNA片断因变性而成单链。

第二步——500C温度下，引物DNA结合在适于配对的DNA片断上。

第三步——700C温度下，由合成酶（DNA高温聚合酶）催化，从引物开始合成目的基因DNA。第十二页，共二十二页，2022年，8月28日

PCR的三个步骤为一次循环，约需5－10分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过20次循环，即可扩增

106

倍，总共只需几个小时。第十三页，共二十二页，2022年，8月28日（4）构造重组DNA分子首先要有载体。

载体有好几种，常用的有：

质粒－－环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。

噬菌体DNA－－线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。第十四页，共二十二页，2022年，8月28日返回用质粒构建重组DNA分子第十五页，共二十二页，2022年，8月28日返回用噬菌体DNA构建重组DNA分子第十六页，共二十二页，2022年，8月28日

其次要把目的基因“装”到载体中去。“安装”的过程，需要好几种工具酶，其中关键的酶叫限制性内切酶。

此酶识别一定碱基序列，有的还可切出“粘性”末端，使得目的基因和载体的连接非常容易。图一图二第十七页，共二十二页，2022年，8月28日下图限制性内切酶识别特定的碱基序列第十八页，共二十二页，2022年，8月28日返回限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA分子的构建第十九页，共二十二页，2022年，8月28日（5）转化/转染—表达—蛋白质分离

把构造好的重组DNA分子送进寄主细胞，亦需要适当的技术方法。若受体细胞是细菌，通常称转化；若受体细胞是动/植物细胞，通常称转染。第二十页，共二十二页，2022年，8月28日

重组DNA分子进入寄主细胞后，其中的目的基因能否表达，表达效率高低，还有很大差别。表达通常是指