分子生物学实验报告

PCR基因扩增实验目的：通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。实验仪器：基因扩增仪移液器实验试剂：10×PCR缓冲液(含Mg2＋)4种dNTPTaq酶DNA模板两种引物（正向引物和反向引物）实验步骤:`1、按顺序向微量离心管中依次加入：ddH2O20μlDNA样品5μl10×PCR缓冲液5μldNTP4μl引物I5μl引物Ⅱ5μl混匀。2、PCR反应参数(1)94℃变性2(2)94℃变性30sec(3)66℃退火30sec(4)72℃延伸1min(5)重复(2)-(4)40次（6）72℃延伸7min（7）4℃3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10μlPCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。实验结果：照片结果图123412341.10ul样品2.样品3.DNA相对分子质量标准4.对照DNA琼脂糖凝胶电泳实验目的：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性的溶液中带有负电荷，因此，在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。实验仪器：1.电泳仪；2.紫外检测仪；3.水平电泳槽；4.移液枪；5.一次性手套。实验试剂：配置1000ml5xTBEpH8.0Tris5硼酸27.5g0.5mol/LEDTA20ml2、EB溶液溴化乙锭溶液（0.5ug/ml）3、凝胶加样缓冲液（6x）溴酚蓝0.25％蔗糖40％4、琼脂糖实验步骤：1、琼脂糖凝胶的制备：（1）称取琼脂糖0.3g，加入30ml0.5xTBE缓冲液，在微波炉上加热溶解，取出摇匀，配制成1％琼脂糖凝胶；稍凉后加入配好的EB溶液数滴。（2）取有机玻璃内槽，洗净晾干，用橡皮膏将机玻璃内槽两端密封，将有机玻璃内槽放置一水平位置，并放好样品梳子。将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶溶液倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面。（3）冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中。（4）加入电泳缓冲液至电泳槽中。2、加样用移液枪取缓冲液，依次点1—2ul缓冲液在一次性手套上。再取样品溶液5ul左右，加入缓冲液中，混匀后，将溶液加到样品孔中，并记录好点样顺序。同时在另一样品孔中加入标准分子量DNA。3、电泳：加入pH8.0Tris－硼酸－EDTA缓冲液后，接通电泳槽与电泳仪的电源，最高电压不超过5V/cm，电泳至溴酚蓝走到胶底部边缘时停止电泳。染色及观察：电泳完毕，取出凝胶模具，将其浸入溴化乙锭染色液中，染色15min后将其推到一块干净的玻璃板上，于254nm、300nm或360nm波长紫外灯下观察，DNA存在的位置呈现桔红色荧光条带，照相。实验结果上图为质粒DNA和酶切产物的电泳结果DNA重组实验目的通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。实验原理：外源DNA片段和线状质粒载体的连接就是DNA重组，在Mg2+和ATP存在下，DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。受体细胞经过CaCl2处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子，即带有异源DNA分子的受体细胞。关于转化子的筛选利用α-互补现象筛选方法。载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。宿主细胞带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,载体和宿主细胞编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在他们融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去α-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。实验仪器与材料仪器：恒温摇床、恒温水浴器、恒温培养箱、台式离心机、低温离心机材料：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠(Nacl)、氨苄青霉素、氯化钙(CaCl2)、二甲基甲酰胺、EcoRI酶、T4DNA连接酶、pUCl9质粒、DH5a、λDNA、培养皿、接种针、玻璃涂棒、试管、酒精灯、镊子、牙签等实验步骤制备重组DNA取灭菌的Eppendorf管，先后加入pUC19质粒1μl，2μl酶切缓冲液，1μlEcoRI酶，无菌双蒸水15ul，至反应混合物总体积20ul，离心混匀，37℃反应3h在另一灭菌的Eppendorf管中，加λDNA1.5ug，1μl酶切缓冲液，1μlEcoRI酶，无菌双蒸水补到10ul，37℃反应3h将酶解液加入1/10体积的3mol/LKAc溶液，在加2倍体积无水乙醇，-20℃冰箱，2h沉淀DNA。12000r/min4℃离心15min，弃上清，加70%乙醇洗沉淀，再离心，去上清，真空干燥后，加5ulTE溶液。将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液1ul，T4DNA连接酶1ul，14℃保温14h，并作转化试验。制备涂菌的琼脂板LB培养基含100ug/ml氨苄青霉素，琼脂15g/l,倒入培养皿，保存。制备感受态细胞在200ul新制备感受态细胞中，加入5ul连接产物，混匀，冰上放置30min。同时做两个对照。受体菌对照：200ul新制备感受态细胞+2ul无菌双蒸水质粒对照：200ul0.1mol/lCaCl2+pUCl9质粒DNA溶液。将管放在42℃水浴，1—2min冰上放置1——2min每管加800ulLB培养基，37℃温育45min，慢摇。在预制的LB琼脂平板上，加40ul20mg/mlXgal和4ul200mg/mlIPTE溶液，涂布于平板上。将感受态细胞均匀涂布于培养皿上，37℃温箱30min，至液体被吸收。倒置平板37℃培养12—16h，出现菌落。其中白色菌落为重组DNA质粒。实验结果大肠杆菌感受态细胞的制备及转化试验目的:学习大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法及技术试验原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫做感受态。在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。细菌在0℃CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA实验仪器与材料仪器超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、—70℃冰箱、恒温水浴器材料氯化钙(CaCl2)、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠(Nacl)、氨苄青霉素、大肠杆菌DH5a、pUCl9质粒、50mL离心管、吸头、小指管、试管、培养皿、锥形瓶等。试剂（1）0.1mol/LCaCl2溶液（2）LB液体培养基配置每升培养基，应950ml去离子水中加入：胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl5——10g加水定容至1L，调节pH7.0，121℃湿热灭菌20min。（3）氨苄青霉素，用无菌水配制成100mg/ml溶液，置冰箱保存。（4）LB固体培养基：每升中加15g琼脂。实验步骤：从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2mlLB液体培养基试管中，37℃振荡过夜。取0.5ml过夜培养液，接种于50mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2-3hr，至OD600<=0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）将培养液1.5ml分装入1.5ml离心管中，4℃离心，4000rpm×10min，弃去上清。重复第4步。用冰浴的0.1MCaCl20.5ml悬浮30min。4℃离心，4000rpm×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1MCaCl2-甘油溶液100μl分装细胞，每200ul一份，-70℃冻存备用，此为感受态细胞。取新鲜制备的200L感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。加入2l重组质粒，轻轻混匀。冰上放置30分钟。同时做两个对照。受体菌对照：200ul新制备感受态细胞+2ul无菌双蒸水质粒对照：200ul0.1mol/lCaCl2+2ulpUCl9质粒DNA溶液。于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴每管加800lLB培养液，37℃250转／分振荡培养10.将培养物适量涂于含氨苄青霉素1%琼脂LB平板上。11．平皿在37℃下正向放置12-16小时，待琼脂凝胶表面没有液体流动后，将平皿倒置，培养过夜12-16h大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验注意事项：制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，高压灭菌20min。实验结果：在含氨苄青霉素的培养基上生长的菌落即为含有pUC19质粒的大肠杆菌外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测实验目的1.通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。2.学习SDS—PAGE的基本操作，学会用SDS—PAGE检测蛋白。一外源基因在大肠杆菌中的诱导表达实验原理：

将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖)，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS检测或做Western-blotting，用抗体识别之。原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位──操纵子（元），如乳糖（lac）操纵子、阿拉伯糖（ara）操纵子及色氨酸（trp）操纵子等。操纵子机制在原核基因调控中具有较普遍的意义。目标基因被克隆到不为大肠杆菌RNA聚合酶识别的T7启动子之下，因此在加入T7RNA聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到pET载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入IPTG诱导表达；使用大肠杆菌启动子系统(如tac、lac、trc、pL)有困难的许多基因已经在pET系统中稳定克隆和表达。T7RNA聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的50%。T7表达系统大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬箘体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬箘体转录体系。最终受T7噬箘体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。T7RNA聚合酶的转录调控的模式决定了表达系统的调控方式。调控方式为化学信号诱导性。T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性就会影响它的生长。解决这一问题的办法之一就是在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因。因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖外，还与T7RNA聚合酶结合抑制其转录活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质粒导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目标基因的表达水平没有明显影响。此外还有其他表达系统，如营养调控型、糖原调控型、pH调控型等。实验仪器：恒温摇床、培养用锥形瓶、超净工作台、低温离心机、干热灭菌箱、材料：克隆在E.coli表达栽体中的外源基因、酵母提取物(yeastextract)、胰化蛋白胨(tryptone)、氯化钠(Nacl)、甘油、氨苄青霉素(ampicillin,Amp)、异丙基硫代—b—D—半乳糖(IFTG)、滤菌膜，滤器、移液管、吸头，小指管实验步骤：1、含外源基因的表达菌株在LB（含50ug/mlAmp）固体培养基中预培养过夜2、以1/50—1/100的比例接种于上述LB培养液中于37℃恒温摇床，250r/min。培养至3、加入50μl1mol/LIPTG（终浓度0.5nmol/L），进行外源基因的诱导表达。于37℃恒温摇床，250r/min。继续培养4—54、4℃，低温离心，4000r/min，20min，收集菌体备用，放在-20°C二SDS检测表达蛋白实验原理：蛋白质与SDS结合后，均带有负电荷，在电场下，按相对分子质量大小在板状胶上排列。实验仪器：平板电泳槽及配套的玻璃板，胶条，梳子、普通恒压恒流电泳仪实验材料：十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺(Acr)、N’，N’—亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(G1y)、盐酸(HCl)、过硫酸胺(Aps)、四甲基乙二胺(TENED)、低相对分子质量标准蛋白、预染标准蛋白、溴酚蓝、甘油、冰醋酸、乙醇、琉基乙醇、琼脂、考马斯亮蓝R250试剂：1.5mol/LTrisHCl，pH8.8（4°C保存）20.5mol/LTris-HCl，pH6.8（4°C保存）10%SDS（室温保存）30%Acr/Bis（29.2gAcr+0.8gBis双氧水定容至100ml过滤，4°C保存）10%Aps（-20°C保存）2x上样缓冲液0.5mol/LTrisHCl，pH6.82ml甘油2ml20%SDS2ml0.1%溴酚蓝0.5ml2-b-巯基乙醇1.0ml双氧水2.5ml室温存放备用；5x电泳缓冲液Tris7.5g甘氨酸36gSDS2.5g加双氧水至500ml，使用时稀释五倍考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R2500.2g+84ml95%乙醇+20ml冰醋酸，用双氧水定容至200ml；脱色液95%乙醇：冰醋酸：水=4.5：0.5：5，体积比保存液：7%冰醋酸封底胶：1%琼脂操作步骤（1）配制分离胶配制10%分离胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为pH8.8）：不同浓度的凝胶的成分和用量单位（ml）凝胶浓度（%）7.51012151820双蒸水1.5mol/LTris。HCL（PH8.8）55555510%（w/v）SDSAcr/Bis(30%)56.658121213.2TEMED10101010101010%Aps根据被分离的外源蛋白的相对分子质量选择凝胶浓度，将所有成分混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水，约40min，等胶自然凝聚后倾斜倒出蒸馏水，并在两玻璃夹缝中水平插入1.5mn的梳子（在胶面上加入蒸馏水称水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶）。（2）4%浓缩胶的配置。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为pH6.8）：4%分离胶的配制成分成分用量双蒸水6.1ml0.5mol/LTris。HCL（PH6.8）2.5ml10%（w/v）SDS100μlAcr/Bis(30%)1.3mlTEMED10μl10%Aps50μl总体积10ml混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。溶液凝固后。小心拔出梳子，用100ul注射器抽取电极缓冲液冲洗梳子拔出后的加样凹槽底部，清除未凝固的丙烯酰胺。（3）将表达后的菌体与2x上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中，100°C沸水中煮3~5min。然后立即插入冰中。（可在-20°C冰柜中保存）（10）用微量移液器在侧面的一个加样槽中加入120μl蛋白分子量标准Marker，其它槽中加入10～20μl自己制作的样品。接好电极，将电流调至1mA/孔，待溴酚蓝移到分离胶后，在将电压调至120V，当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm时切断电源。把分离胶从玻璃上剥离，倒染于含适量的考马斯亮蓝染色液液搪瓷盘里（切不可损坏胶！）。（4）染色2h后，将染液倒回瓶子里以备重复使用。把胶移入脱色液，过夜。观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量（CHI蛋白约30kDa），判断是否是预期的基因产物。实验结果：质粒DNA的提取及酶切实验目的：1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法;2、了解制备原理及各种试剂的作用。实验原理：在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。实验仪器：1、材料含有质粒pUC19质粒的大肠杆菌菌液2、仪器离心机，移液器3、试剂（1）、LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，用NaOH调pH至7.5，15磅高压灭菌15分钟。固体培养基加1.5℅的琼脂。（2）、溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.HClpH8.0,10mmol/LEDTA（3）、溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH，2%SDS用前等体积混合（4）、溶液Ⅲ5mol/LKAc溶液60ml，11.5ml冰醋酸，28.5ml去离子水。（5）、Tris.HCl饱和酚:固体苯酚在沸水浴中加热融化，160℃重蒸酚冷却至室温后加入等体积的1MTris.Cl(pH8.0)缓冲液,充分振荡;加入固体Tris(1g/100ml酚)摇匀溶解,于室温静置,待分层