章十微生物的分类和鉴定

第一节 通用分类单元一、种以上的系统分类单元界Kingdom门Phylum（或Division）——亚门纲Class——亚纲 ——超目 目Order——亚目 科Family——亚科 ——族 ——亚族 属Genus 种Species必要时可添加“亚”、“超”、“族”当前1页，总共76页。种的概念种的定义：种是一个基本分类单位，是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有明显差异的菌株的总称。在微生物中，一个种只能用该种内的一个典型菌株作为具体标本，它就是该种的模式种。新种：sp.nov.或nov.sp.，新被鉴定的种，在以往权威性的分类、鉴定手册中从未记载过的微生物。发表时应在其学名后标上sp.nov.的符号，新种发表前应将其模式菌株的培养物应存放在一个永久性的保藏机构中，并应允许人们从中取得。当前2页，总共76页。种的分类地位举例当前3页，总共76页。二、微生物的学名学名：菌种的科学名称。菌种的学名是按照《国际细菌命名法规》命名的国际学术界公认，并通用的名称。命名原则：学名=属名+种的加词+（首次定名人）+现名定名人和鲜明定名年份规定与常识：属名应大写首字母、单数、可以组合外而成。种的加词代表一个种的次要特征，首字小写当前4页，总共76页。(一)双名法当前5页，总共76页。(二)三名法在少数情况下，当某种是一个亚种（subspecies，简称“subsp．”，排正体字）或变种*（variety，简称“var．”，排正体字）时，学名就应按“三名法”构成。当前6页，总共76页。(三)有关学名的其它知识1.属名2.种名加词3.学名的发音当前7页，总共76页。1.属名当前8页，总共76页。2.种名加词当前9页，总共76页。3.学名的发音当前10页，总共76页。三、亚种以下的几个分类单元（一）亚种（二）变种（三）型（四）菌株/品系/毒株当前11页，总共76页。（一）亚种是一种进一步细分种时所用的单元。一般指除了某一明显而稳定的特征外，其余鉴定特征与模式种相同的种。命名方法按“三名法”（二）变种是亚种的同义词。不主张再用。（三）型作若干菌株变异型的后缀。当前12页，总共76页。（四）菌株/品系/毒株/株任何由一个独立分离的单细胞（或单个病毒）繁殖而成的遗传型上纯的群体及其后代叫菌株。同一菌种的不同菌株间，主要性状相同，但一些生理生化性状却存在差异；菌株是物种内遗传多样性的客观反映，其数目是无数的；菌株与克隆概念相同；某一菌株发生稳定变异的后代需要重新命名；菌株的确定：实验室可以自己命名。EscherichiacoliK12,E.coliO-157：H7当前13页，总共76页。亚种以下的分类单元亚种（subspeciers）：种的进一步细分，一般指其某一民而稳定的特征与模式中不同的种常在种名、署名的加词后写上subsp.然后再写具体亚种的加词；变种（variety）：容易引起混乱；型form：使用中用型作为后缀；表示细菌菌株，现已作废；类群（group）：没有分类地位非正式地指定一组具有某些共同性状的生物；菌株（strain）：表示任何由一个独立分离的单细胞繁殖而成的纯种群体极其一切后代；实际上是一个微生物达到遗传性纯的标志。小种（race）：涵义较乱，在不同分支学科中由不同涵义；相（phase）：自然界存在的微生物交互变异的一定阶段；态（state）：通常指微生物的菌落变异状态。当前14页，总共76页。当前15页，总共76页。一、生物的界级分类学说二、三域学说及其发展第二节 微生物在自然界的地位当前16页，总共76页。第二节 微生物在自然界的地位生物的界级分类学说：是在认识发展过程中存在的对生物分类的不同阶段的不同观点。如：二界系统、三界系统、四界系统、五界系统、六界系统和三原界系统三原界系统是1978年由R.H.Whittaker和L.Margulis提出的。所有生物存在一个共同祖先，由它分三条进化路线，就形成了三个原界：古细菌原界（Archaebacter）、真细菌原界、真核生物原界提出了内共生学说，主要是Margulis的贡献当前17页，总共76页。三原界系统示意图当前18页，总共76页。一、生物的界级分类学说1.二界系统2.三界系统3.五界系统当前19页，总共76页。生物界级学说发展的示意图。阴影部分指微生物。当前20页，总共76页。1.二界系统：1753Linnaeus标准：取食方式、光和作用、运动性、细胞壁

动物界植物界当前21页，总共76页。2.三界系统：1866Heackel新物种的发现，如细菌有壁、无光合作用动物界植物界原生生物界—原始或古老的生命形式、单细胞及无核类当前22页，总共76页。3.五界系统：1969（Whittaker）原生生物界(Protista)：单细胞藻类、原生动物、粘菌真菌界(Fungi)：真菌、酵母菌原核生物界(Monera)：细菌、蓝细菌植物界(Plantae)动物界（Animalia）当前23页，总共76页。原核生物真核单细胞生物真核多细胞生物光合营养吸收式营养摄食式营养当前24页，总共76页。导管植物绿藻门苔藓植物子囊菌门担子菌门接合菌门粘菌节肢动物脊椎动物肉足虫孢子虫甲藻金藻门细菌蓝藻原核生物界原生生物界动物界真菌界植物界当前25页，总共76页。二、三域学说及其发展1980（Woese）16sRNA共同的祖先古细菌域：产甲烷细菌、极端嗜盐菌、极端嗜酸热菌真细菌域：除古细菌原界以外的细菌真核生物域：原生生物、真菌、动物、植物当前26页，总共76页。嗜热菌真细菌原界紫色细菌G+细菌绿色非硫细菌蓝细菌黄杆菌极端嗜盐菌甲烷细菌极端嗜酸热菌动物纤毛虫真菌植物鞭毛虫微孢虫原始祖先RNA?真核原界古细菌原界当前27页，总共76页。内共生假说现今一切生物都有一个共同的远祖进化而来。小细胞先分化出细菌和古生菌。古生菌分支上的细胞丧失细胞壁后，先后吞噬了α变形细菌（相当于G-细菌）和蓝细菌，并形成了内共生，从而使两者进化成与宿主细胞难分难解的细胞器—线粒体和叶绿体，于是宿主最终也就发展成了各类真核生物。当前28页，总共76页。三域学说及其生物进化谱系树当前29页，总共76页。促使人们提出三原界学说的最重要原因是具有一系列独特性状的曾称作“第三生物”的古细菌的发现。与真细菌相比，古细菌有以下几个特点：

（1）细胞膜的类脂特殊古细菌所含的类脂是不可皂化的。其中的中性类脂以类异戊二烯（isoprenoid）类的烃化物为主，极性类脂则以植烷甘油醚（phytanylglycerolethers）为主。（2）细胞壁成分独特而多样有的以蛋白质为主，有的含杂多糖，有的类似于肽聚糖（“假肽聚糖”），但不论是何种成分，它们都不含胞壁酸、D型氨基酸和二氨基庚二酸。（3）核糖体的16SrRNA其核苷酸顺序独特，既不同于真细菌，也不同于真核生物。（4）tRNA成分其核苷酸顺序也很特殊，且不存在胸腺嘧啶。（5）蛋白质合成的起始密码始于甲硫氨酸，与真核生物相同。（6）对抗生素等的敏感性对那些作用于真细菌细胞壁的抗生素如青霉素、头孢霉素和D-环丝氨酸等不敏感；对真细菌的转译有抑制作用的氯霉素不敏感；对真核生物的转译有抑制作用的白喉毒素却十分敏感。（7）生态条件独特有的是严格厌氧菌，如产甲烷菌（metnanogens）；有的是极端嗜盐菌（extremehalophiles）；有的则是嗜热嗜酸菌当前30页，总共76页。当前31页，总共76页。当前32页，总共76页。第三节各大类微生物的分类系统纲要一、Bergey原核生物分类系统纲要二、Ainsworth的真菌分类系统纲要当前33页，总共76页。各大类微生物的分类系统纲要原核生物分类系统纲要——伯杰氏系统细菌学手册真菌界分类系统很多，各国采用不同的系统，比较混乱。近年来为较多人接受的是Ainsworth的纲要。当前34页，总共76页。一、Bergey原核生物分类系统纲要《伯杰氏鉴定细菌学手册》1sted,1923；8thed,1974,15个国家、130多位科学家参与撰写；9thed,1994;其不同版本代表了出版时的细菌分类的最新成果。70年代以来该书所提出的分类系统已被各国学术界普遍采纳。大量的分子生物学资料的采用似的原核分类已从以往的以表型、实用性鉴定指标为主的旧体系向以遗传型为基础的系统进化分类新体系逐渐转变。当前35页，总共76页。

《伯杰氏系统细菌学手册》1sted,1984-1989,分为4卷；是在《伯杰氏鉴定细菌手册》8thed的基础之上增加了大量的分子生物学资料。但由于当时细菌系统发育的资料仍较零碎，所以有相当一部分类群未能科目级别分类，从实际需要出发，主要根据表型特征将整个原核生物分为33组，33个组的划分见表。国际上最为流行的版本。微生物分类技术和学术理论的发展促进了生物科学的进步。2eded,2000开始出版，分为5卷，提出完整的系统分类，将原核生物分为：古细菌界（2门、5组、8纲、11目、17科、63属、208种）；细菌界：（16门、26组、27纲、62目、163科、814属、4727种）；反映了人们对生物系统发育的深刻认识。当前36页，总共76页。当前37页，总共76页。二、Ainsworth等人的菌物分类系统纲要

（用菌物代替以往的真菌）

目前广为接受Ainsworth第7版的分类系统及第八版菌物界当前38页，总共76页。Ainsworth等人的菌物分类系统纲要

当前39页，总共76页。当前40页，总共76页。第四节微生物分类鉴定的方法一、微生物分类鉴定的经典方法二、微生物分类鉴定中的现代方法当前41页，总共76页。微生物的鉴定主要步骤：纯化、测定一系列必要的指标、查找权威性鉴定手册鉴定方法分四个水平：细胞的形态和习性水平：形态特征、运动、酶反应、营养要求及生长条件等细胞组分水平：细胞壁成分、氨基酸库、脂类、醌类、光合色素等的分析蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等基因或DNA水平：核酸分子杂交、（G+C）mol%、转化和转导、16SrRNA寡核苷酸族分分析、DNA或RNA核苷酸序列分析等当前42页，总共76页。一、微生物分类鉴定的经典方法（一）经典的鉴定指标（二）微型、简便、快速、自动化鉴定技术当前43页，总共76页。（一）经典鉴定指标当前44页，总共76页。当前45页，总共76页。（二）微型、简便、快速、自动化鉴定技术1.API细菌数值鉴定系统2.Enterotube系统3.Biolog全自动和手动细菌鉴定系统当前46页，总共76页。1.API细菌数值鉴定系统当前47页，总共76页。2.Enterotube系统

（肠管系统）当前48页，总共76页。3.Biolog全自动和手动细菌鉴定系统全自动仪器和手动仪器鉴定96孔的细菌培养板，其中95孔中各加有氧化还原指示剂和不同的发酵性碳源的培养基干粉，另一个孔为清水对照。鉴定前先把待检纯种制成适当浓度的悬液，再吸入有八个头子的接种器中，接着用接种器按12下，即可接种完96孔菌液。在37℃下培养，把培养基平板放入检测室用分光光度计检测，再通过计算机系统最终确定该样品为何种微生物。当前49页，总共76页。二、微生物分类鉴定中的现代方法（一）通过核酸分析鉴定微生物遗传型（二）细胞化学成分用作鉴定指标（三）数值分类法当前50页，总共76页。（一）通过核酸分析鉴定微生物遗传型1.DNA碱基比例的测定2.核酸分子杂交3.rRNA寡核苷酸编目4.微生物全基因组序列的测定当前51页，总共76页。1.DNA碱基比例的测定两个菌株G+Cmol％值相差：<2%无分类意义；2.5-4.0%种内菌株；>5%不同的种；>10%不同的属。DNA碱基比例的测定即G+C%测定，是利用增色效应测定Tm值，用Tm值确定某微生物DNA中的G+Cmol％值。当前52页，总共76页。2.核酸分子杂交DNA-DNA杂交法DNA-rRNA杂交法rRNA-rRNA杂交法杂交同源性:>60%,同种>70%,同一亚种20%-60%,同一属当前53页，总共76页。当前54页，总共76页。3.rRNA寡核苷酸编目分析rRNA普遍存在,易于提取;rRNA重要恒定的生理功能;在细胞中含量大，易于提取；编码rRNA的基因在细胞中不像质粒DNA那样会转移，而是十分稳定的

；rRNA的非常保守性--进化尺度;16S/18SrRNA核苷酸数量适中,信息量大,易于分析。在原核生物核糖体所含的三种rRNA（23S，16S和5S，见图11-11）中，其核苷酸数分别约为2900、1540和120个，其中的16SrRNA不但核苷酸数适中，而且信息量较大且易于分析，故是理想的研究材料。

分析生物细胞中rRNA寡核苷酸序列同源性，以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的方法。选用rRNA做生物进化和系统分类的原因当前55页，总共76页。当前56页，总共76页。原理：水解rRNA，产生很多长短不一的寡核苷酸片段，电泳分离，放射自显影技术获得指纹图谱，确定不同长度寡核苷酸斑点在电泳谱上的位置，找出图谱中链长在6个核苷酸以上的寡核苷酸片段作序列分析，获得的结果进行按不同长度进行编目、列表。通过比较、分析、计算，就可知道各菌株间的亲缘关系大小。若两种或两株微生物的亲缘关系越近，则其产生的寡核苷酸片段的序列也越接近，反之亦然。3.rRNA寡核苷酸编目分析当前57页，总共76页。通过T1RNA酶的水解，一般可使rRNA形成含有1～20个核苷酸单位的寡核苷酸片段。如果形象地把只含一个核苷酸的片段称为“字母”的话，则含两个以上核苷酸的片段就成了“单词”。将含有6个“字母”以上的所有“单词”一一测定其核苷酸序列，最后可把它们编成一部“词典”。于是，两个茵株rRNA的相似性就可通过查阅“词典”来作比较。比较的具体方法是计算它们间的缔合系数（associatedcoefficient）或相关系数SAB值：上式中，NAB是A、B两被测菌株所共同具有的“单词”的“字母”数，而NA和NB则是两株菌分别具有的“单词”的“字母”数。根据SAB值进行数值分析，就可推知它们之间的亲缘关系。它的作用很大，至今Woese及其同事已对400多株细菌和放线菌进行过分析，并从其中发现了生命的第三种形式——古细菌，提出了生物界级分类中的“三域学说”当前58页，总共76页。当前59页，总共76页。4.微生物基因组全序列的测定正式公布:53种正在进行:100种当前60页，总共76页。当前61页，总共76页。（二）细胞化学成分用作鉴定指标1.细胞壁化学成分2.全细胞水解液的糖型3.磷酸类脂分析4.枝酸菌的分析5.醌类的分析6.气相色谱技术用于微生物鉴定当前62页，总共76页。1.细胞壁化学成分根据肽尾第3位氨基酸的种类、肽桥结构、肽桥交联的位置，肽聚糖可以分为5类。当前63页，总共76页。第3位为内消旋的二氨基庚二酸（meso-DAP），第3位为赖氨酸（Lys），第3位为L-DAP第3位为L-鸟氨酸（L-Orn），第3位氨基酸的种类不固定当前64页，总共76页。2.全细胞水解液的糖型以放线菌为例。它们的糖型可分四类当前65页，总共76页。3.磷酸类脂分析磷酸类脂是极性类脂，位于细菌、放线菌的细胞膜上。不同属放线菌其磷脂类组分有所不同，故分析这一成分是鉴别放线菌属的重要指标之一。磷酸类脂的种类很多，其中有5种可用于作为鉴定指标：①磷脂酰乙醇胺（PE）；②磷脂酰甲基乙醇胺（PME）；③磷脂酰胆碱（PC）；④磷脂酰甘油（PG）；⑤含葡萄糖胺未知结构的磷酸类脂（GluNu）。当前66页，总共76页。4.枝酸菌的分析枝菌酸（mycolicacid）存在于Nocardia、Mycobacterium和Corynebacterium等属称作“诺卡氏菌形放线菌”中，它们是一些在形态上具有初生菌丝体，并多少呈规律性断裂成球状或杆状小体的一类放线菌。其形态结构简单，且细胞壁化学组分都为Ⅳ型，但它们所含的枝菌酸却差别明显，例如，分枝杆菌的枝菌酸（mycobactomycolicacid）约含80个碳原子，诺卡氏菌的枝菌酸（nocardomycolicacid）约含50个碳原子，而棒杆菌的枝菌酸（corynemycolicacid）则约含30个碳原子，因此，可分析其所含的枝菌酸来对它们分属。当前67页，总共76页。5.醌类的分析在细菌和放线菌中所含有的醌类物质主要可分两大类，即甲基萘醌（menaquinone，即维生素K）和泛醌（ubiquinone，即辅酶Q）。在它们的分子中各有长度为1～14个异戊烯单位不等的侧链，除了多烯侧链长度不同以外，多烯链的氢饱和度（或氢化度）也不同，这些特点就使醌的分析成为近年来放线菌分类鉴定上有相当重要价值的方法。据研究，大多数细菌含有甲基萘醌、泛醌或两者均有，但革兰氏阳性细菌和放线菌只含有甲基萘醌。放线菌所含甲基萘醌的异戊烯侧链长度和氢饱和度都有较大的变化（8～10个异戊烯单位，一般为部分饱和）。当前68页，总共76页。6.气相色谱技术用于微生物鉴定气相色谱技术（gaschromatograph，GC）是一种新型的物理及物理化学分离分析方法，具有极高的选择性、分离效率、灵敏度和分析速度，为微生物细胞组分和代谢产物的分析带来了较理想的分析方法，并由此产生了一门气相色谱化学分类学（gaschromatography-chemotaxonomy）。1963年，Able等首次通过细胞脂肪酸的分析来对细菌进行分类，同时，Oyama等又提出了用裂解气相色谱法（Pyrolysisgaschromatography，PGC，是一种热裂解法与色谱技术相结合的方法）来鉴定