微生物学实验

微生物学实验

暨南大学生命科学技术学院生物工程学系微生物学实验室参考教材：沈萍陈向东《微生物学实验》（第四版）高等教育出版社适用于生物科学、生物技术等专业微生物学实验实验一环境微生物的检测（P5-8）学习检测环境中微生物的方法；观察不同类群微生物的菌落形态特征，比较不同环境中微生物的类型和数量；体会无菌操作的重要性。实验项目号：80000039101实验类型：验证性实验目的：微生物学实验基本原理：环境中的微生物在营养丰富的培养基平板中经过培养即可长成肉眼可见的菌落，从而可检测到环境中存在的微生物的类型和数量。实验材料：营养琼脂平板、灭菌棉签、恒温培养箱等微生物学实验实验方法和步骤：（P6-7）

每四个同学为一组，每个同学一个营养琼脂平板，每人各选取以下其中一种处理方法（或你感兴趣的其他方法），写好标签：实验室空气中的微生物：比较培养基暴露于空气不同时间的区别：打开皿盖，把培养基平板暴露于空气中10min，盖好皿盖；打开皿盖，把培养基平板暴露于空气中30min，盖好皿盖；2.比较洗手前后手指上微生物的区别：在培养皿底部用记号笔分四个区（A、B、C、D区），洗手前后分别用手指在培养基表面轻按。（注意不要按碎培养基。）盖好皿盖。3.口气中的微生物：打开皿盖，对着培养基吹气。4.实验台面的微生物：用灭菌棉签揩拭实验台面，再用此棉签在培养基表面滚动一下，也可用同样方法检测你所感兴趣的其他地方或物品。

处理完成后，盖好皿盖，倒置培养皿，置于37℃温箱培养1-2天观察，记录实验结果。微生物学实验实验结果：

将实验结果记录于下表（P8）：表1：微生物检测的结果记录表处理方法（1）（2）（3）（4）菌落数量菌落特征（大小、形状、透明度、颜色等）简要说明菌落数量可用“+”和“-”来表示，从多到少依次表示为++++，+++，++，+，-微生物学实验分析及讨论：思考题：通过本次实验，在防止微生物污染与扩散方面，你学到了些什么？有何体会？

微生物学实验实验二显微镜的使用和细菌基本形态的观察（P40-47）

学习并掌握显微镜，特别是油镜的工作原理和使用方法

；熟练使用显微镜观察细菌的个体形态。实验项目号：80000039101实验类型：验证性实验目的：微生物学实验1.光学部分:接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等).它使检视物放大,造成物象.2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件.它起着支持调节固定等作用.显微镜的构造基本原理：微生物的个体很小，必须要借助显微镜才能看清其形态。微生物学实验1.放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数2.

显微镜的分辨率是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：D=λ/2n·sin(α/2)式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。：可见光的波长（平均0.55m)n:物镜和被检标本间介质的折射率。：镜口角（即入射角）。显微镜的放大倍数和分辨率微生物学实验

1.香柏油的折射率与玻璃接近，提高了视野的照明度。

2.提高了显微镜的分辨率油镜使用的原理微生物学实验实验材料：玻片标本：球状：四联球菌（Micrococcustetragenus

）杆状：枯草杆菌（Bacillussubtilis

）螺旋状：水弧菌（Vibrioaquatilis）示范片：溶血链球菌（Streptococcushemolyticus）其他器材：显微镜、香柏油、清洁剂、擦镜纸等微生物学实验用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。调节光亮度低倍镜观察：粗调、细调高倍观察：细调油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋开高倍镜，在标本中央滴一滴香柏油，转过油镜，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。换片：另换新片，必须从“3”开始操作。标本片的清洁：用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量清洁剂擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的清洁剂，后将镜体全部复原。实验方法和步骤：（P44-45）主要是油镜的使用微生物学实验1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.观察标本时，必须依次用低、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。显微镜保养和使用中的注意事项：微生物学实验四联球菌链球菌水弧菌枯草杆菌细菌基本形态的观察

利用油镜，观察细菌的基本形态（球状、杆状和螺旋状），边观察边绘图。微生物学实验观察结果（绘图）P46分析及讨论：菌名拉丁学名放大倍数绘出在油镜下观察到的形态图，注意菌体的形态、大小比例、排列，同时标明菌名(包括拉丁学名)和放大倍数（物镜的放大倍数×目镜的放大倍数）微生物学实验用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加香柏油有什么作用？镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？影响显微镜分辨率的因素有哪些？思考题：（P47）微生物学实验实验三细菌简单染色及革兰氏染色学习微生物制片、染色的基本技术；了解革兰氏染色的原理，掌握革兰氏染色的方法；巩固油镜的使用方法，熟练观察细菌的个体形态。

实验项目号：80000039102

实验类型：验证性

实验目的：微生物学实验基本原理：简单染色：

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态。染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类，通常采用碱性染料进行染色。因细菌在中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，而染料电离后的染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色。微生物学实验根据细胞壁结构和成分的不同革兰氏染色法（细菌学上最常用的鉴别染色法）：微生物学实验实验材料：菌种：枯草杆菌（Bacillussubtilis）大肠杆菌（Escherichiacoli）

染色液和试剂：革兰氏染色液、简单染色液等芽胞、鞭毛、荚膜的示范片其他器材：显微镜、香柏油、清洁剂、擦镜纸等微生物学实验简单染色：（材料：牙垢）涂片→干燥→固定→染色（1-2min）→水洗→干燥→油镜检→绘图革兰氏染色：（材料：大肠杆菌、枯草杆菌）涂片→干燥→固定→结晶紫初染（1-2min）→水洗→碘液媒染（1min）→

水洗

→酒精脱色（30s内）→水洗

→番红复染（2min）→水洗→干燥→油镜检，判断菌体的革兰氏染色结果→绘图实验方法和步骤：微生物学实验观察标本片细胞结构菌名染色方法图例芽胞枯草杆菌（Bacillussubtilis）芽胞染色法鞭毛变形杆菌(Proteusvulgaris)鞭毛染色法荚膜圆褐固氮菌（褐球固氮菌）（Azotobacterchroococcum）负染色法微生物学实验实验结果:绘图革兰氏染色的结果牙垢中的细菌100×10枯草杆菌（示芽胞）拉丁学名放大倍数变形杆菌（示鞭毛）拉丁学名放大倍数圆褐固氮菌（示荚膜）拉丁学名放大倍数菌名形状简图颜色革兰氏染色结果大肠杆菌枯草杆菌微生物学实验在进行细菌涂片时应注意哪些环节？P75—(1)进行细菌制片时为什么要进行加热固定？在加热固定时应注意什么？P76—(2)你的革兰氏染色是否成功？有哪些问题需要注意，为什么？P84—(1)现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定杆菌是G+还是G-，如何确定你的染色结果的正确性？P84—(2)思考题：（P47）分析及讨论：微生物学实验实验四放线菌、酵母菌、霉菌个体形态的观察

四大类微生物菌落形态的观察学习放线菌、酵母菌、霉菌的制片方法，观察其个体形态了解四大类微生物的菌落特点，学会从菌落形态区分四大类微生物。实验项目号：80000039103

实验类型：验证性实验目的：微生物学实验基本原理：1.放线菌（P72-73）：印片法：用于观察气生菌丝、孢子丝的形态、孢子的排列方式及形态。2.酵母菌（P73）：用吕氏碱性美兰染色做水浸片，可区分死活细胞：

死细胞→→→蓝色活细胞→→→无色3.霉菌（根霉）（P74）：挑菌做水浸片直接观察。微生物学实验青霉根霉曲霉细黄链霉菌（放线菌）酵母菌微生物学实验实验材料：菌种：细黄链霉菌（平板）、酿酒酵母（试管斜面）、黑根霉（平板）玻片标本：青霉、黑曲霉菌落标本：

细菌（大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌）放线菌（细黄链霉菌）酵母菌（酿酒酵母）霉菌（黑曲霉、黑根霉）染料：石碳酸复红、吕氏碱性美兰、乳酸酚其他器材：微生物学实验放线菌（菌种：细黄链霉菌平板）

印片法：用接种铲取一小块菌苔（连同培养基）放在一块载玻片上→取另一块载玻片稍加热并在其上轻压→固定→用石碳酸复红做简单染色片→油镜检→绘图实验方法和步骤：微生物学实验酵母菌（菌种：酿酒酵母）

在载玻片上滴一滴美兰→用接种环取少量酵母菌与染料混匀→盖上盖玻片（注意防止气泡的产生）→镜检（高倍镜）→绘图霉菌（菌种：根霉）

在载玻片上滴一滴乳酸酚→用解剖针小心挑取少许根霉的菌丝放在染料中→盖上盖玻片（注意防止气泡的产生）→镜检（低倍镜或高倍镜）→绘图标本片的观察：（青霉、曲霉）菌落形态的观察：微生物学实验微生物学实验实验结果:绘出所观察微生物的个体形态图（细黄链霉菌、酿酒酵母、根霉、青霉、曲霉，注意标注清楚各部分结构的名称）菌名拉丁学名放大倍数微生物学实验列表比较四大类微生物的菌落特征类群菌名菌落大小干湿颜色表面边缘厚薄致密度气味细菌放线菌酵母菌霉菌四大类微生物的菌落特征微生物学实验根据你的观察结果，吕氏碱性美兰染色的作用时间与酵母菌死活细胞的比例的变化是否有关系？试分析原因。P76-（10）黑曲霉和黑根霉在个体形态和菌落形态上有何区别？P76-（12）思考题：分析及讨论：微生物学实验实验五显微镜直接计数法

及微生物大小的测定（P47-56)了解血球计数板的构造和使用方法，学会用血球计数板对酵母菌悬液进行计数。学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法。实验项目号：80000039104

实验类型：验证性实验目的：微生物学实验基本原理：

每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。

设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，

1.显微镜直接计数法:(P52)

微生物学实验

采用目镜测微尺和镜台测微尺测量微生物细胞的大小。镜台测微尺一般是将1mm等分为100格，因此每格长10μm，而目镜测微尺在不同放大倍数下的每格所代表的长度是不同的，使用前须用镜台测微尺校正，以求得在一定放大倍数下的实际长度。2.微生物大小的测定：(P48)微生物学实验实验材料：菌种：酿酒酵母菌悬液，枯草杆菌斜面其他器材：血球计数板，目镜测微尺，镜台测微尺，显微镜，盖玻片，载玻片，染色液等微生物学实验1.显微镜直接计数法：（菌种：酿酒酵母）

镜检计数室→加样品→静止5分钟→显微镜计数（每个计数室选5个中格）→记录结果→清洗血球计数板2.微生物大小的测定：（菌种：枯草杆菌）做枯草杆菌的简单染色片安装目镜测微尺（已安装好）并用镜台测微尺在各物镜下校正目镜测微尺在油镜下测定菌体大小：分别测10个菌的宽和长，求平均值，再将所测格数乘以目镜测微尺（油镜）下每格代表的长度，即得该菌的实际大小。实验方法和步骤：微生物学实验实验结果:1.显微镜直接计数：

计算并报告该菌悬液的浓度：（写成科学记数法，保留2位有效数字）表1：显微镜直接计数的结果A表示五个中方格中的总菌数；

B表示菌液稀释倍数。各中格菌数A两室平均A值B菌液浓度（菌数/ml）12345第一室第二室微生物学实验2.微生物大小的测定：接物镜物镜放大倍数目镜测微尺格数物镜测微尺格数目尺每格的长度（

μm）

低倍镜高倍镜油镜表2：用镜台测微尺校正目镜测微尺的结果12345678910平均宽（格）长（格）表3：枯草杆菌细胞大小测定的结果计算出枯草杆菌的大小：宽=μm

长=μm

表示为：宽×长（保留小数点后1位）微生物学实验

根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？2.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？思考题：分析及讨论：微生物学实验实验六微生物的分离纯化及生理生化试验了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程；了解干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法的原理，掌握其灭菌方法。实验项目号：80000039105

实验类型：

综合性

实验目的：Ⅰ、培养基的配制及灭菌（P15-28）

微生物学实验基本原理：

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖和积累代谢产物的营养基质，包括碳源、氮源、能源、矿物元素、生长因子和水等生长要素。不同微生物对营养物质和pH的要求是不同的。培养基在使用之前必须要处于无菌状态，故要先灭菌。灭菌方法：高压蒸汽灭菌法（121℃/20min

）

烘箱干热灭菌法（160-170℃/1-2h

）原理及适用物品？

微生物学实验根据来源可分为:

天然培养基(complex/undefinedmedium):

合成培养基(definedmedium):

半合成培养基(semi-definedmedium)：根据使用目的可分为:

（生物）鉴别培养基(differentialmedium)

选择培养基(selectedmedium)：根据形状可分为:

固体培养基（solidmedium）：

半固体培养基（semi-solidmedium）：

液体培养基（liquidmedium）：

培养基的类型和用途

微生物学实验实验材料：药品试剂：营养琼脂培养基、马铃薯培养基设备材料：高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、天平、药匙、电炉、烧杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、试管、棉塞、培养基、吸管、线绳、标签等。微生物学实验配制培养基的一般程序：按使用目的选择培养基----按培养基配方称量各种药品----加热溶化----调pH（用1mol/L的HCl或NaOH)----趁热分装----加棉塞----包扎、标注-----灭菌-----试管摆斜面实验方法和步骤：微生物学实验每组配制的量：项目培养基名称配制量及分装做法灭菌培养基的配制（每一实验桌分成三组，每4人一组，分别配制培养基）1.营养琼脂：（牛肉膏蛋白胨培养基、细菌培养基）(2人）三角瓶：2瓶（150ml/瓶）/2人一组试管斜面：16支（约5ml/支）/2人一组三角瓶：直接称取相应的干粉培养基置于三角瓶内，另加0.5%的琼脂，加水加塞、灭菌试管斜面：每2人一组，称取100ml量的干粉培养基置于烧杯内，另加0.5%的琼脂，加水煮溶，分装高压蒸汽灭菌法（121℃/20min）2.马铃薯培养基（2人）无菌水试管：10支/4人（4.5ml/支）大三角瓶：1瓶（100ml）/4人自来水分装、加塞、灭菌即得无菌培养皿每人10套皿（5套/包）包扎灭菌高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法（160-170℃/1-2小时）无菌吸管每人5支1ml的吸管加过滤棉花、包扎灭菌即得微生物学实验P20---（2）

P20---（8）

P27---（2）

P27---（3）六.思考题：五.分析及讨论：微生物学实验实验六微生物的分离纯化及生理生化试验掌握稀释平板法、平板划线法分离纯化微生物的原理及方法；学习平板菌落计数法的基本原理和方法，并掌握其基本技能。实验项目号：80000039105

实验类型：

综合性

实验目的：Ⅱ、微生物的分离纯化及活菌计数（P28-34）

微生物学实验基本原理：

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。微生物在固体培养基上生长形成单个菌落，通过挑取单菌落而获得一种纯培养。常用方法：稀释平板法、平板划线法基本原理：1.选择合适的培养基配方；2.提供合适的生长环境，如酸碱度、温度和氧气；3.加入某种抑制剂，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物学实验实验材料：培养基：营养琼脂（牛肉膏蛋白胨培养基、细菌培养基）、马铃薯培养基土壤样品：从校园采集溶液和试剂：盛4.5ml无菌水试管、盛99ml无菌水三角瓶等。其他用品：无菌培养皿、无菌吸管、接种环、酒精灯等微生物学实验

制备土壤稀释液---加样----倒平板--倒置培养----挑菌划线纯化----镜检----得到纯种----接种到试管培养----保藏实验方法和步骤：流程：微生物学实验1.制备土壤稀释液：每管各4.5ml无菌水吸取1ml吸取1ml15-20ml融化并冷却至45℃的培养基微生物学实验2.按下表，根据所要分离的微生物种类，选择适当的稀释液浓度，吸取1ml稀释液加到灭菌培养皿中，每个稀释度3个重复；分离的微生物所用培养基稀释液的浓度培养温度培养时间细菌营养琼脂10-5、10-6、10-737℃1-2天霉菌马铃薯培养基10-2、10-3、10-428℃2-3天微生物学实验3.倒入溶化并冷却到45℃的相应的培养基，迅速混匀，待冷凝后倒置于相应温度的培养箱中培养；

4.培养相应时间后观察平板上菌落的生长情况，区分细菌、霉菌的菌落，记录相应的菌落数；

5.挑取单菌落划线（霉菌的要求点接）纯化(每个纯种一个编号，编号原则：菌别-班别-座位号-菌号），镜检，纯种移接到试管培养。几种划线方法微生物学实验实验结果:1.记录培养后平板上相应微生物的的菌落

注：CFU/g土样=每个平板上的菌落平均数×稀释倍数稀释度10-510-610-7每个平板上细菌的菌落数123平均123平均123平均细菌CFU/g土样稀释度10-210-310-4每个平板上霉菌的菌落数123平均123平均123平均霉菌CFU/g土样微生物学实验按照P33和P207-208的方法，分析上面的实验数据，报告每克土样中所含的细菌、霉菌的CFU数。描述你所纯化得到的菌种的菌落形态和个体形态。微生物学实验1.怎样判断稀释平板计数数据是否可靠？需要掌握哪几个关键？P34---（3）

2.当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的，而是集中在一起时，你认为问题出现在哪里？P34---（6）

3.一个酵母菌的悬液样品，分别用血球计数板直接计数法和平板菌落计数法进行计数，其结果会有什么不同？原因是什么。试比较这两种计数法的优缺点。七.思考题：六.分析及讨论：微生物学实验实验项目号：80000039105

实验类型：

综合性

（一）、实验目的：Ⅲ、微生物的生理生化试验1.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法；2.掌握进行抗生素的抗菌试验的原理和方法。实验六微生物的分离纯化及生理生化试验大分子物质的水解试验及抗生素的抗菌试验（P111）微生物学实验（二）、基本原理：1.大分子物质的水解试验：微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输到细胞内。如淀粉酶将淀粉水解为小分子的糊精、双糖、单糖。蛋白酶水解蛋白质为小肽、氨基酸等，这些过程均可通过观察微生物菌落周围的物质变化来证实，如在淀粉平板上淀粉被水解后滴加碘液时会出现不呈蓝色的透明圈，在酪蛋白平板（牛奶平板）上蛋白质被分解会出现透明圈。2.抗生素的抗菌试验：

抗生素为某些微生物的次生代谢产物，会积累在培养基质中。把待试验的微生物连同培养基块置于加有供试菌株的平板表面，经培养，观察菌块周围是否有抑菌圈出现，就可知道该菌株是否产生相应的抗生素。微生物学实验（三）、实验材料：培养基：酪蛋白平板（牛奶平板）、淀粉平板、营养琼脂平板菌株：前个实验分离到的各种菌株（写明编号）、大肠杆菌（Escherichiacoli）

、青霉(Penicilliumsp.)、细黄链霉菌（Stretomycesgriseus）、枯草杆菌溶液和试剂：路哥氏碘液其他用品：无菌培养皿、无菌吸管、接种环、酒精灯等微生物学实验点接微生物菌种30℃培养2天观察透明圈大小酪蛋白平板1.蛋白质水解试验：（自己分离的细菌、霉菌和枯草杆菌对照）

2.淀粉水解试验：（自己分离的细菌、霉菌和枯草杆菌对照）

30℃培养2天加碘液，观察透明圈大小（四）、实验方法和步骤：点接微生物菌种微生物学实验3.抗生素的抗菌试验：（自己分离的霉菌和青霉、细黄链霉菌对照）

加0.2ml大肠杆菌悬液涂布均匀挑取菌块置于培养基表面营养琼脂平板37℃培养2天观察抑菌圈大小微生物学实验（五）、实验结果:表1大分子物质水解结果记录表微生物类型菌株名或编号蛋白质水解试验淀粉水解试验抗生素的抑菌试验细菌------枯草杆菌------放线菌细黄链霉菌-----------霉菌青霉----------将实验结果填入表1，“+”或“++”表示阳性，“-”表示阴性微生物学实验

在选择平板上形成的透明圈的大小是否就能作为产酶能力的直接证据？透明圈的大小还受什么因素的影响？（七）、思考题：（六）、

分析及讨论：微生物学实验（一）、实验目的：二、糖发酵试验、柠檬酸盐试验和半固体穿刺法（P115-121）

了解糖发酵试验、柠檬酸盐试验的原理，掌握通过这些试验鉴别不同微生物的方法。学习半固体穿刺法观察细菌的运动性及细菌的生长与氧的关系