LD02-细胞中心法则与基因工程技术原理

生命最重要的本质之一是性状特征自上代传至下代——遗传。妈妈百日照片女儿百日照片1第一页，共55页。关于遗传，是大家经常讨论的一个话题孩子会与父母有许多相似之处，如性格、身材高矮、体形胖瘦、肤色深浅、眼睛大小、鼻子高低……很多很多都与父母的遗传有关还有很多疾病的发生也与父母的遗传密切相关。2第二页，共55页。中心法则遗传信息信使性状第三页，共55页。中心法则的发展与补充1.遗传信息从RNA流向RNA，即RNA的复制2.遗产信息从RNA流向DNA，即逆转录（常见于病毒的增殖）第四页，共55页。

复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。第五页，共55页。第六页，共55页。DNA的结构

四种脱氧核苷三磷酸ATCG（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2.A=T，C三G两两配对3.每条链由5’端向3’端延伸4.两条链反向平行成双螺旋结构第七页，共55页。与DNA复制有关的酶和蛋白质

原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA。酶：DNA聚合酶，DNA连接酶，拓扑异构酶等能量：ATP引物：一小段RNA(或DNA）为引物第八页，共55页。DNA的复制观看视频1观看视频2总结：目的——细胞生长、增殖，遗传信息特点——半保留复制（保证遗传的稳定性）；一条链连续复制、另一条链不连续（与DNA合成方向5’->3’有关）第九页，共55页。端粒与寿命细胞生长、增殖端粒是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构，像两顶帽子那样盖在染色体两端，因而得名。端粒在维持染色体和DNA复制的完整性方面有重要作用。随着细胞分裂DNA复制次数的增加，端粒的长度是在逐渐缩短的，当端粒变得不能再短时，细胞不再分裂而死亡。Cell：早期端粒酶失活将加速衰老JCICHESTJ：端粒突变更易患肺部疾病TheFASEBJournal：逆转生命时钟，延长细胞端粒GenesDevel：科学家发现控制细胞衰老的开关—端粒酶PLoSOne：揭示焦虑症、过早衰老与染色体端粒的缩短直接相关PNAS：个体的端粒长度可能预测寿命长短第十页，共55页。端粒与寿命观看视频：端粒与寿命可见，端粒的缩短限制了人类的生命跨度，但另一方面也能限制癌症的发生，所幸我们还能做点什么，因为端粒缩短的程度也受到你的生活方式与环境的影响。NatureGenetics：研究发现端粒更长增患脑癌风险CancerEpidemBiomarker：端粒长度越短患胰腺癌风险越高PNAS：家庭贫穷儿童端粒变短BritishJournalofSportsMedicine：少坐一会儿，端粒就能变长吗？Circulation：运动有助于保持白细胞端粒长度PLOSGenetics：咖啡或啤酒可能会影响端粒长度第十一页，共55页。定义:以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA称为逆转录，由逆转录酶催化进行。逆转录合成DNA第十二页，共55页。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的逆转录过程

（以前病毒形式引起整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化）

单链病毒RNA

RNA-DNA杂交分子双链DNA（前病毒）

逆转录酶逆转录酶

逆转录酶是多功能酶：

RNA指导的DNA聚合酶活性

DNA指导的DNA聚合酶活性逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿5’3’方向合成DNA，并要求短链RNA作引物。第十三页，共55页。cDNA：几乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段polyA,当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。逆转录酶发现的理论和实践意义：不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。1983年，发现人类免疫缺陷病毒（humanimmunedeficiencevirus,HIV）,感染T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）第十四页，共55页。RNA的生物合成一、RNA聚合酶

二、RNA的转录过程

三、转录后加工

四、RNA的复制

第十五页，共55页。转录：以DNA的一条链为模板在RNA聚合酶催化下，按照碱基配对原则，合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链的过程称为转录。以四种核糖核苷三磷酸酸（NTP）为底物，形成3、5-磷酸二酯键相连接。二、RNA的生物合成：第十六页，共55页。一、关于RNA合成过程中的几个概念：1、模板链（无义链）：指导RNA合成的那条链。2、编码链（有义链）：与模板链互补的那条链。3、启动子：DNA分子上结合RNA聚合酶，并形成转录起始复合物的区域。4、终止子：促进转录停止的特殊 DNA序列。可分两类：依赖ρ因子的和不依赖

ρ因子的。第十七页，共55页。二、真核生物与原核生物基因的区别：1、真核生物基因内部有内含子是断裂的、不连续的，而原核生物内部则没有。2、真核生物基因一般是独立的，而原核则一般是由多个基因联合在一起而形成操纵子结构。如：大肠杆菌的乳糖操纵子。真核生物内含子结构原核生物操纵子结构第十八页，共55页。观看视频：乳糖操纵子模型操纵子Operon:基因表达的协调单位,它们有共同的控制区和调节系统。包括在功能上彼此有关的结构基因和控制部位.第十九页，共55页。二、RNA的转录过程RNA的转录过程：（以大肠杆菌为例）

起始位点的识别

转录起始链的延伸转录终止第二十页，共55页。（1）起始位点的识别

RNA的合成不需要引物。体外实验证明，不含σ亚基的核心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有σ亚基时就会选择正确的起点。σ亚基起着识别DNA分子上的起始信号（启动子——指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列）的作用。启动子的结构至少由三部分组成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；第三部分是RNA合成的起始点。AACTGTATATTATTGACATATAAT+1转录起始点5’3’3’5’35序列

Sextama框10序列Pribnow框第二十一页，共55页。（2）转录起始

RNA聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，σ亚基就会被释放脱离核心酶。因子仅与起始有关，RNA的合成一旦开始，便被释放E-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板链第二十二页，共55页。（3）RNA链的延伸DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与DNA结合比较松弛，可沿DNA模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的RNA链的3’-OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向从5’

3’第二十三页，共55页。（4）转录终止

在DNA分子上（基因末端）提供转录停止信号的DNA序列称为终止子（terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并释放出RNA。

需要ρ因子（终止因子，协助RNA聚合酶识别终止信号）帮助，ρ因子能与RNA聚合酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的RNA链。不依赖于ρ因子。强终止子序列有两个明显的特征：（1）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域。（2）富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U（连续6个）。弱终止子：缺少回文结构强终止子：有回文结构第二十四页，共55页。第二十五页，共55页。三、RNA的转录后加工

在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物（primarytranscript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。第二十六页，共55页。mRNA前体的加工：

原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。亦有少数多顺反子的mRNA需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。

真核生物mRNA（半寿期较长）原初转录物很大，在加工过程中形成许多分子大小不等的中间物，它们被称为核内不均一RNA（heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)，需要进一步进行加工修饰转化为mRNA。加工包括：（1）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列拼接上(真核生物一般为不连续基因)。（2）3’端添加polyA“尾巴”；（3）5’端连接“帽子”结构（m7G5ppp5NmpNp-）；（4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。第二十七页，共55页。观看视频：RNA的合成总结：目的——释放遗传信息（mRNA）以表达性状与功能特点——受到精细化调控，有时空特异性第二十八页，共55页。蛋白质的生物合成蛋白质合成体系的重要组成部分

蛋白质的合成过程

蛋白质合成后的运送第二十九页，共55页。蛋白质与氨基酸六伴穷光蛋：硫、半、光、蛋→半胱、胱、蛋（甲硫）氨酸→含硫氨基酸酸谷天出门：酸、谷、天→谷氨酸、天冬氨酸→酸性氨基酸死猪肝色脸：丝、组、甘、色→丝、组、甘、色氨酸→一碳单位来源的氨基酸只携一两钱：支、缬、异亮、亮→缬、异亮、亮氨酸→支链氨基酸一本落色书：异、苯、酪、色、苏→异亮、苯丙、酪、色、苏氨酸→生糖兼生酮拣来精读之：碱、赖、精、组→赖氨酸、精氨酸、组氨酸→碱性氨基酸芳香老本色：芳香、酪、苯、色→酪、苯丙、色氨酸→芳香族氨基酸不抢甘肃来：脯、羟、甘、苏、赖→脯、羟脯、甘、苏、赖氨酸→不参与转氨基的氨基酸DNA能够编码20种天然氨基酸，它们几乎是细胞生命中一切氨基酸的合成单体第三十页，共55页。牛胰岛素蛋白结构20种结构各异、物理化学性质不同的氨基酸，赋予了蛋白质无限可能的结构与空间构象第三十一页，共55页。mRNA和遗传密码mRNA由DNA经转录合成，携带着DNA的遗传信息，然后作为模板通过翻译将遗传信息传递给蛋白质，即由它直接决定多肽链中AA的顺序。所以mRNA为模板的蛋白质合成过程被称为翻译或转译。mRNA分子中四种不同碱基（A、G、C和U）构成特定顺序决定蛋白质分子中20种氨基酸所构成的序列。大量实验证明mRNA上相邻三个碱基编码一种氨基酸，因而被称为碱基三联体或密码子。四种核苷酸，能有43=64组密码子第三十二页，共55页。

遗传密码阅读方向为5‘-3’第三十三页，共55页。

遗传密码的特点

⑴密码子的方向性

密码子的阅读方向及它们在mRNA由起始信号到终止信号的排列方向均为5-3’，与mRNA链合成时延伸方向相同。

⑵密码子的简并性

64-3=61个代表20种氨基酸，仅甲硫氨酸、色氨酸只有一个密码子。一个氨基酸可以有几个不同的密码子，编码同一个氨基酸的一组密码子称为同义密码子。这种现象称为密码子的简并性。

第三十四页，共55页。⑶密码子的连续性（读码）（无标点、无重叠）

从正确起点开始至终止信号，密码子的排列是连续的。既不存在间隔（无标点），也无重叠。在mRNA分子上插入或删去一个碱基，会使该点以后的读码发生错误，称为移码，由这种情况引起的突变称为移码突变。⑷密码子的基本通用性（近于完全通用）对于高等、低等生物都适用，只有一个例外：真核生物线粒体DNA。（P397）一些原核生物中利用终止密码翻译AA（UGA-Trp\硒代半胱氨酸）3‘起始密码子5‘第三十五页，共55页。⑸起始密码子和终止密码子64种密码子中，AUG为甲硫氨酸的密码子，又是肽链合成的起始密码子，UAA，UAG，UGA为终止密码子，不编码任何氨基酸，而成为肽链合成的终止部位（无义密码子）。⑹密码子的摆动性（变偶性）如丙氨酸：GCU，GCC，GCA，GCG，只第三位不同，显然密码子的专一性基本取决于前两位碱基，第三位碱基有较大灵活性。发现tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对时，密码子的第一位、第二位碱基配对是严格的，第三位碱基可以有一定变动，这种现象称为密码的摆动性或变偶性（wobble）。IA、U、C配对。第三十六页，共55页。mRNA是蛋白质生物合成的直接模板。tRNA的作用体现在三个方面：3ˊCCA接受氨基酸；反密码子识别mRNA链上的密码子；连接多肽链和核糖体。第三十七页，共55页。tRNA有两个关键部位：

⑴3’端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。需ATP提供活化氨基酸所需的能量。

⑵与mRNA结合部位—反密码子部位（tRNA的接头作用）3’5’ICCA-OH5’3’CCA-OHGGCCCG密码子与反密码子的阅读方向均为5‘3’，两者反向平行配对。tRNA凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码子相识别，把所带氨基酸放到肽链的一定位置。第三十八页，共55页。合成场所——rRNA及核糖体

核糖体是由几十种蛋白质和几种rRNA组成的亚细胞颗粒,其中蛋白质与rRNA的重量比约为1:2。核糖体是蛋白质合成的场所。第三十九页，共55页。原核和真核生物的核糖体的构成生物核糖体核糖体的亚基rRNA原核生物70s50s、30s16s、5s、23s、真核生物80s60s、40s18s、5s、5.8s、28srRNA序列成为微生物生物学种属鉴定的主要依据第四十页，共55页。蛋白质肽链的合成步骤

一、氨基酸的活化

二、肽链合成的起始

三、肽链的延伸

四、肽链合成的终止与释放

五、真核细胞蛋白质生物合成

六、肽链合成后加工和折叠第四十一页，共55页。一、氨基酸的活化氨基酸在掺入肽链前必须活化。氨基酸的活化是指各种参加蛋白质合成的氨基酸与携带它的相应的tRNA结合成氨酰-tRNA的过程。活化反应在氨酰-tRNA合成酶的催化下进行。氨基酸活化的总反应式是：

氨基酸+ATP+tRNA+H2O氨酰-tRNA+AMP+PPi氨酰-tRNA合成酶因此，氨基酸的活化是消耗能量ATP与载体tRNA连接的过程。第四十二页，共55页。二、肽链合成的起始

起始密码子的识别：以原核生物大肠杆菌为例

起始密码子AUG上游（5’端）约10个核苷酸处有一段富含嘌呤的序列（SD序列、RBS），原核生物核糖体30S小亚基上的16SrRNA3’端富含嘧啶的序列能与之互补配对，这样30S亚基能与mRNA结合，识别起始密码子AUG。第四十三页，共55页。在肽链合成起始时，首先是核糖体小亚基与mRNA上的核糖体结合位点识别结合，然后，大亚基与小亚基结合，形成完整的核糖体(70S起始复合物)。

f

f第四十四页，共55页。消炎药：链霉素、新霉素、卡那霉素与原核细胞30S核糖体结合，阻止50S核糖体亚基与之结合，从而抑制其蛋白质合成。蛋白质合成抑制剂第四十五页，共55页。三、肽链的延伸1、进位新的氨酰-tRNA进入A位。需要消耗GTP。2、转肽

在肽酰转移酶的作用下P位点上fMet-tRNAf的甲酰甲硫氨酸从相应的tRNA上解离下来，其-COOH（高能酯键）与刚进入A位的氨酰-tRNA上的-NH2形成肽键，此时A位点携带一个二肽。第四十六页，共55页。PA5’3’3、移位在移位酶的作用下，核糖体沿mRNA5’3’方向移动，每次移动一个密码子的距离，结果使原来在A上的肽酰-tRNA移到了P位点，同时一个新的密码子进入空的A位。PA5’3’PAPPAA以上三步为一个延伸循环，肽链每掺入一个氨基酸就重复一次延伸循环。肽链从N-C合成第四十七页，共55页。第四十八页，共55页。四、肽链合成的终止与释放当终止密码子出现在A位时，终止因子结合在A位，肽链合成终止。

RF1：识别终止密码子UAA和UAGRF2：识别终止密码子UAA和UGARF3：具GTP酶活性，激活RF1和RF2活性，协助肽链的释放终止因子的结合使肽酰转移酶活性变为水解酶活性，肽基不转移给A位tRNA，而转移给H2O，并把已