荧光定量PCR(徐歆改)

实验七荧光定量PCR当前1页，总共31页。简介定量PCR：检测PCR反应指数期某一点的PCR产物数量，由此确定初始模板的数量。荧光定量PCR（real-timeQ-PCR）：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线或内参基因对未知模板进行定量分析的方法。1996年由美国AppliedBiosystems公司推出该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点当前2页，总共31页。荧光定量PCR的优点荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量既能用于定性，判断一段DNA序列的有无，也可用于定量，确定起始DNA拷贝数当前3页，总共31页。荧光定量PCR扩增曲线荧光定量PCR扩增曲线并非标准的指数曲线，而是S形曲线，并可分为反应早期、指数期和线性期和平台期。即使是重复实验，保证各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也有所不同PCR结束后的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况同一样品尽管平台期DNA拷贝数波动很大，但指数期产物量相同当前4页，总共31页。PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光信号之后进入指数增长阶段。软件自动给出，无需手动设置。荧光域值（Threshold）为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（或本底的2倍）。软件自动给出，可手动设置。Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。荧光域值与Ct值当前5页，总共31页。Ct值与DNA模板每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数当前6页，总共31页。非特异性荧光标记SYBRGreenI常用荧光标记方法特异性荧光标记TaqManProbe当前7页，总共31页。游离状态荧光很弱，但与DNA双链结合后荧光强度增加1000倍！其信号强度代表了双链DNA分子（即PCR产物）的数量SYBRGreenI染料法当前8页，总共31页。SYBRGreenI染料法缺点：能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，产生假阳性信号，但通过熔解曲线（meltingcurve）的分析，优化反应条件加以解决。对引物特异性要求高（关键）不能进行多重定量，增加模板使用量优点：对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA使用方便，无需设计复杂探针，检测方法简便成本低当前9页，总共31页。熔解曲线分析引物二聚体PrimerdimersProductofInterest当前10页，总共31页。5’端标记有报告基因（Reporter，R），如FAM、VIC等3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q）探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan探针法每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步当前11页，总共31页。TaqMan探针法荧光标记物的选择当前12页，总共31页。不同定量方法的比较当前13页，总共31页。绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度相对定量：在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化，相对定量常见于比较两个样本中基因表达水平的高低变化定量方法当前14页，总共31页。绝对定量当前15页，总共31页。拷贝数的计算样品DNA浓度（ng/μl）=OD260×40×稀释倍数样品分子量=质粒碱基对总数×660拷贝数（copies/μl）=样品DNA浓度/样品分子量×6.02×1014倍比梯度稀释方法梯度1：原液（106copies/μl）梯度2：1份原液+9份稀释缓冲液，105copies/μl梯度3：1份梯度2溶液+9份稀释缓冲液，104copies/μl梯度4：1份梯度3溶液+9份稀释缓冲液，103copies/μl梯度5：1份梯度4溶液+9份稀释缓冲液，102copies/μl梯度6：1份梯度5溶液+9份稀释缓冲液，10

copies/μl质粒标准品稀释方法与拷贝数计算当前16页，总共31页。以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作标准曲线标准曲线的绘制当前17页，总共31页。标准曲线的绘制以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线扩增效率（E）=（10-1/斜率-1）×100%相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好E应介于95%与105%，越接近100%越好当前18页，总共31页。未知样品拷贝数的计算将未知样品的CT值（y）代入线性方程求得对应的x未知样品的拷贝数=10x当前19页，总共31页。管家（内参）基因：维持细胞基本代谢活动所必须的基因，不随外界刺激发生变化或变化不大常用的有：beta-actin，GAPDH，18SrRNA等原理：以管家基因的表达量为参照，定量目的基因的表达量前提：管家基因与目标基因的扩增效率相似且接近100%方法：2-△△CT（Livak）法用管家基因的CT值归一目标基因的CT值：

△CT＝目标基因的CT－管家基因的CT

用对照组的△CT值归一处理组的△CT值：

△△CT＝处理组△CT－对照组△CT相对表达水平比率=2-△△CT（对照组为1）相对定量当前20页，总共31页。∆CtSample∆CtNontreatedsampleHousekeepingGene∆Ct∆Ct∆∆

Ct2-∆∆

Ct

=ChangeinExpressionLevelGeneofInterest相对定量当前21页，总共31页。PCR反应体系以TAKARASYBR®

PremixEx

TaqTMII为例试剂使用量终浓度SYBRPremixEx-Taq(2×)10μL1×PCRForwardPrimer(10μm)0.8μL0.4μmPCRReversePrimer(10μm)0.8μL0.4μmROXReferenceDye(50×)0.41×DNA模板2μLdH2O6μLTotal20μL当前22页，总共31页。ABI7500Real-TimePCR System当前23页，总共31页。程序的设置（相对定量）背参染料的荧光强度不随PCR反应变化，用于校正孔与孔之间的荧光干扰或反应体积变化对SYBR®GREEN荧光强度的影响当前24页，总共31页。两步法PCR扩增标准程序染料法的荧光采集step在每个循环的扩增step后当前25页，总共31页。结果的查看当前26页，总共31页。数据的导出当前27页，总共31页。引物的设计NCBIGenbank查询目的基因mRNA序列根据mRNA序列中的CDS设计引物要求：17~24个碱基，CG=40~60%,Tm≈60℃引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡结构跨越内含子设计引物Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出1000bp以下的非目的产物当前28页，总共31页。绝对定量与相对定量的比较方法优点缺点适用范围绝对定量定量准确工作量较大，需额外绘制目标基因的标准曲线所有相对定量工作量较小，直接进行PCR扩展，无需绘制保准曲线需考虑多个因素以保证准确性：所选的管家基因在各样品中表达水平相近；目标基因和管家基因的扩增效率相似或接近100%拥有管家基因的样品当前29页，总共31页。注意事项操作：取/拿PCR单管/8联管/96孔板时，切勿触碰管盖或光学贴膜，最好戴一次性手套操作，勿在盖子或贴膜