分子印迹渍与分子杂交技术

分子印迹渍与分子杂交技术第1页，共59页，2023年，2月20日，星期三固相支持物应具备的特点：1)具有较强的结合核酸分子的能力（>10µg/

cm2

）2)与核酸结合后，不影响其与探针分子的杂交反应。3)与核酸稳定牢固结合，能经受杂交、洗膜等操作过程。4)非特异性吸附少，洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉。5)具有良好的机械性能，如柔软性，柔韧性。第2页，共59页，2023年，2月20日，星期三几种常用固相支持物1)硝酸纤维素虑膜（nitrocellulosefiltermembrane）具有较强吸附单链DNA和RNA的能力（高盐下达80µg/

cm2

～100µg/

cm2

）。真空烘干后，依靠疏水性相互作用。杂交本底较低。－－不易反复杂交和洗膜（结合力）－－质地较脆，烘烤后更甚，小心操作－－与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳，不易核酸电转第3页，共59页，2023年，2月20日，星期三2)

尼龙膜（nylonmembrane）结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达350µg/

cm2

～500µg/

cm2

）。真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后,

部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA

变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。韧性较强，操作方便。能结合小分子核酸。低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。可反复杂交和洗膜。－－杂交本底较高第4页，共59页，2023年，2月20日，星期三3)

化学活化膜（chemicalactivatedmembrane）将虑膜用一定的化学物质处理后即形成化学活化膜（如ABM和APT纤维素膜），这种化学活化膜经特殊处理而活化，产生活化基团（重氮盐）与DNA或RNA分子共价结合。

DNA与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太多。对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（NC、NL不具备)－－结合能力较NC膜低－－活化过程较复杂4)

滤纸结合能力较弱，但经济（基因文库粗筛的菌落原位杂交）第5页，共59页，2023年，2月20日，星期三

是指将核酸,蛋白质等生物大分子固定在纤维膜上的过程。将核酸或蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将核酸点到膜上。转膜（1）物理吸印方法（毛细虹吸真空抽吸）（2）电转印方法第6页，共59页，2023年，2月20日，星期三第7页，共59页，2023年，2月20日，星期三印迹（渍）技术SouthernBlot－－DNA（由EdwinMellorSouthern

等人首次应用）（1975年，Southren创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜（NC膜）上，再进行杂交的方法，被称为Southren印迹法。）NorthernBlot－－RNA

（Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为Northern印迹。）WesternBlot－－Protein（immunoblotting)

（1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为Western印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压完成转移。）第8页，共59页，2023年，2月20日，星期三EasternBlot（1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上，称Eastern印迹。）

DotBlotInsituhybridization

第9页，共59页，2023年，2月20日，星期三固相核酸印迹杂交类型Southern印迹杂交（southernblot）Northern印迹杂交（Northernblot）斑点杂交（Dotblot）菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置第10页，共59页，2023年，2月20日，星期三

流程1.将核酸分子酶切成为多个片段2.变性电泳（或者电泳之后变性），使各片段分离3.将凝胶中的核酸片段转移到固相支持物上4.预杂交杂交5.洗膜6.检测第11页，共59页，2023年，2月20日，星期三第12页，共59页，2023年，2月20日，星期三

流程1.将核酸分子酶切成为多个片段2.变性电泳（或者电泳之后变性），使各片段分离3.将凝胶中的核酸片段转移到固相支持物上4.预杂交杂交5.洗膜6.检测第13页，共59页，2023年，2月20日，星期三固相核酸分子杂交类型Southern印迹杂交（southernblot）Northern印迹杂交（Northernblot）斑点杂交（Dotblot）菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置第14页，共59页，2023年，2月20日，星期三斑点杂交（Dotblot）斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如MinifoldI和II、Bio-Dot(Bio–Rad)和Hybri–Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。第15页，共59页，2023年，2月20日，星期三第16页，共59页，2023年，2月20日，星期三（1）DNA斑点杂交①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上。每个样品一般点50μl（2～10μgDNA）。④将膜烘干，密封保存备用。第17页，共59页，2023年，2月20日，星期三RNA斑点杂交：1）与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化）。2）将RNA溶于5μlDEPC水，加15μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含0.15mol/l甲醛）使RNA变性。3）然后取5～8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。第18页，共59页，2023年，2月20日，星期三一种简化的提取和纯化RNA的方法用含0.5%NonidetP40（诺乃洗涤剂）的低渗缓冲液对动物细胞作简单处理，离心去掉细胞核和细胞碎片，就得到基本不带DNA而富含RNA的细胞质提取物，这一粗RNA在高盐下用甲醛变性，不需加工直接点到硝酸纤维素膜上。本法可以快速检测大量标本，而只需极少量的细胞（5×104）或组织。整个RNA实验中，要防止激活内源性Rnase。第19页，共59页，2023年，2月20日，星期三固相核酸分子杂交类型Southern印迹杂交（southernblot）Northern印迹杂交（Northernblot）斑点杂交（Dotblot）菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置第20页，共59页，2023年，2月20日，星期三菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）第21页，共59页，2023年，2月20日，星期三实验步骤如下：①将滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。②培养细菌至产生1～2mm大小的菌落。③在一块平皿中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体。将带有菌落的滤膜取下，轻轻置于滤纸上，菌落面上在，注意防止在滤膜底面存有气泡。④5min后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/lNaCl,0.5mol/LTris·NaCl）浸湿的滤纸上，放置10min。⑤将滤膜转至中和溶液（1.5mol/lNaCl,0.5mol/LTris·HCl，pH8.0）浸湿的滤纸上，放置10min。重复中和1次。⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min。SSPE配成20×贮备液：3.6mol/lNaCl,0.2mol/LNaH2PO4(PH7.4),20mmol/LEDTA(pH7.4)。⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干2h。第22页，共59页，2023年，2月20日，星期三固相核酸分子杂交类型Southern印迹杂交（southernblot）Northern印迹杂交（Northernblot）斑点杂交（Dotblot）菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置第23页，共59页，2023年，2月20日，星期三

组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此,原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置；对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布；与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外，原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）第24页，共59页，2023年，2月20日，星期三

原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素，标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/lHCl处理载玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水，原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳定性上还需要进一步完善和提高用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针。通常探针的长度以100～400nt为宜，过长则杂交效率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16～30nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针。因此，寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交的优选探针。第25页，共59页，2023年，2月20日，星期三

(FISH)fluorescentinsituhybridization第26页，共59页，2023年，2月20日，星期三WESTERNBLOT第27页，共59页，2023年，2月20日，星期三其基本过程为：（1）首先做蛋白质的SDS电泳。（2）然后将凝胶中的蛋白质电转印到固相膜上。（3）在膜上以相应的抗体进行抗原／抗体反应。（4）显色。本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的抗原。第28页，共59页，2023年，2月20日，星期三第29页，共59页，2023年，2月20日，星期三转膜Protein

HRPDABH2O21Ab2Ab洗膜、显色第30页，共59页，2023年，2月20日，星期三mRNA=messengerRNA

ECD=extracellulardomain

ELISA=enzyme-linkedimmunosorbentassay

IHC=immunohistochemistry

CISH=chromogenicinsituhybridization

PCR=polymerasechainreaction

FISH=fluorescenceinsituhybridization第31页，共59页，2023年，2月20日，星期三1.ExtractDNAfromcellExtractRNAfromcellExtractproteinfromcell

Southernblot

Northernblot

Westernblot2.Cutwithrestrictionenzyme3.Runongel(usuallyagarose)Runongel(usuallyagarose)Runongel(usuallypoly-acrylamide–calledPAGE)4.DenaturewithalkaliDenaturewithformaldahydeDenaturewithSDS5.Transferbycapillaryactionbycapillaryactionbyelectrophoresis6.BlockwithexcessDNABlockwithexcessRNA

Blockwithexcessprotein7.HybridizewithlabeledHybridizewithlabeledHybridizewithlabeled

DNAprobe

DNAprobeAntibodyprobe8.Washoffunboundprobe9.AutoradiographAutoradiographAutoradiographordevelopwithchromogenicsubstrate第32页，共59页，2023年，2月20日，星期三分子杂交技术

Hybridizationtechnique

（在DNA与DNA，DNA与RNA之间，存在着碱基互补的关系，在加热或加入变性剂等条件下，DNA双链之间的氢键被破坏，双链解开成为单链，此时加入有互补序列的DNA或RNA，在一定离子强度和温度下保温，则加入的DNA或RNA可与模板链形成稳定的DNA-DNA或DNA-RNA异源双链，此过程称为杂交。）核酸分子杂交的基础不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链

第33页，共59页，2023年，2月20日，星期三碱基碱基糖磷酸基第34页，共59页，2023年，2月20日，星期三碱基互补第35页，共59页，2023年，2月20日，星期三核酸分子杂交的原理第36页，共59页，2023年，2月20日，星期三分子杂交技术的发展1961年，Hall等探针与靶序列在溶液中杂交1962年，Bolton等设计DNA-琼脂技术60年代中期Nygaard等研究应用硝酸纤维素（NC）膜70年代到80年代早期，随分子生物学技术进展，核酸杂交技术有了突破性进展应用：目前核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用于特定基因的表达、基因定位、遗传病的检测、组织病理学的研究、生物分类方面。第37页，共59页，2023年，2月20日，星期三DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针探针的分类根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为第38页，共59页，2023年，2月20日，星期三①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。cDNA探针用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点：

第39页，共59页，2023年，2月20日，星期三RNA探针的主要优点有①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳定性高，杂交反应可以在更为严格的条件下进行（杂交温度可提高10℃

左右），因而杂交的特异性更高。②单链RNA分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待测核酸顺序杂交的效率较高。③RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少。④杂交后可用Rnase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。mRNA中存在的多聚腺苷酸尾，有时会影响杂交的特异性，此缺点可以通过在杂交液中加入poly（A)将待测核酸序列中可能存在的poly（dT)或poly（U)封闭而加以克服。

第40页，共59页，2023年，2月20日，星期三①由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。③一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异，但通过细心筛选序列和/或选择相对长的序列（＞30nt）亦可设计出非常特异的寡核苷酸探针。最常用的寡核苷酸探针有18～40个碱基，目前的合成仪可有效地合成至少50个碱基的探针。下面是筛选寡核苷酸针的一些原则：

寡核苷酸探针第41页，共59页，2023年，2月20日，星期三理想的寡核苷酸探针应具备的条件长18－50nt,较长探针杂交时间较长，合成量低；较短探针特异性会差些碱基成分：G＋C含量为40％－60％，超出此范围则会增加非特异性杂交探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如－GGGGG一旦选下某一序列符合上述标准，最好将该序列与核酸库中序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70％或有连续8个或更多碱基的同源，否则，该探针不能用第42页，共59页，2023年，2月20日，星期三未知序列的基因探针（可以从蛋白质多肽序列推测寡核苷酸序列）其遵循的原则有：1）要尽量选择那些只有一种编码的氨基酸（如色氨酸UGG和甲硫氨酸AUG）的多肽作为合成寡核苷酸探针的参照。2）尽管同一氨基酸可由多种密码子编码，但其使用频率是不一样的，因此应优先考虑使用频率最高的密码子。第43页，共59页，2023年，2月20日，星期三3）前一个氨基酸的密码子也会影响下一个氨基酸密码子的使用，在真核基因中，极少有5’-CG-3’序列出现。在密码子内部凡是存在CG序列的密码子其使用频率也较低。在两个密码子间的情况也是同样。因此在设计寡核苷酸探针时，当两个相邻的氨基酸的最高频率密码子相邻会导致CG序列出现时，应将其中一个氨基酸的密码子换为次高频率密码子。通常是将前一个密码子NNC换为NNT。（甘氨酸GGC(GGA)和苏氨酸ACC(ACA)除外）。4）参考同一基因家族的基因序列，对于密码子的正确选择也是有所帮助的。5)为尽可能减少假阴性结果，可合成各种可能的寡核苷酸探针分别或混合进行探测。混合杂交探测时，由于各探针的（G+C）%含量不同，因此需分别在不同的温度下进行探测。第44页，共59页，2023年，2月20日，星期三人肿瘤坏死因子中第104~116位氨基酸的顺序：glu谷-thr苏-pro脯-glu谷-gly甘-ala丙-glu谷-ala丙-lys赖-pro脯-trp色-tyr酪-glu谷1）选择最高频密码子，碱基序列为：2）修改CG序列，碱基序列为：5’-GAGACCCCTGAGGGAGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAG-3’实际序列（95%）：5’-GAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAG-3’5’-GAGACCCCCGAGGGCGCCGAGGCCAAGCCCTGGTACGAG-3’第45页，共59页，2023年，2月20日，星期三缺口平移法(nicktranslation)DNA快速末端标记随机引物法聚合酶链式反应法化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上探针的制备

第46页，共59页，2023年，2月20日，星期三缺口平移

该技术由Kelly等于1970年创立。其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些缺口（nick）,缺口处会形成3’—羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除。其结果是在缺口平移。根据这个原理，如果用高强度的放射性核苷酸（通常为α-32PdATP）置换先前存在的核苷酸。用缺口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交要求。

第47页，共59页，2023年，2月20日，星期三第48页，共59页，2023年，2月20日，星期三探针的标记缺口平移法(nicktranslation)DNA快速末端标记随机引物法聚合酶链式反应法化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上第49页，共59页，2023年，2月20日，星期三随机引物延伸

这是以单链DNA或RNA模板合成高比活性32P标记探针所选用的方法。原理是使长6～8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反转录酶的作用下，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNA链的合成，在反应时将[α-32P]dNTP掺入合成链，即得到标记。变性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小的探针DNA。因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可与模板DNA随机发生退火反应，因此被称为随机引物（randomprimer）。这种随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。第50页，共59页，2023年，2月20日，星期三第51页，共59页，2023年，2月20日，星期三探针的标记缺口平移法(nicktranslation)DNA快速末端标记随机引物法聚合酶链式反应法化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上第52页，共59页，2023年，2月20日，星期三聚合酶链反应

PCR技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比活性DNA探针。PCR技术具有很高的特异性，可在1～2h之内大量合成探针DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它标记的dNTP，则探针DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物的掺入率可高达70%～80%。因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。该法的缺点是要合成一对特异性PCR引物。使用从探针DNA上制备的小片段作引物也能取得较好的标记效果。第53页，共59页，2023年，2月20日，星期三探针的标记缺口平移法(nicktranslation)DNA快速末端标记随机引物法聚合酶链式反应法化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上第54页，共59页，2023年，2月20日，星期三探针标记物应具备的条件

(探针（probe)是指能与特定的靶分子发生特异性结合并能以特殊的方法被探知的分子.)

高度灵敏性标记物与探针的结合不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化特性esp.Tm值用酶促方法进行标记时酶的活性应不受影响检测应