化学发光分析

化学发光分析第1页，共70页，2023年，2月20日，星期四第一节分子荧光和磷光molecularfluorescenceandphosphorescence第二节分子荧光和磷光分析法molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis第三节分子发光分析chemiluminescenceanalysis第2页，共70页，2023年，2月20日，星期四(对光的吸收)第一节分子荧光和磷光第3页，共70页，2023年，2月20日，星期四历史：第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，他于1575年提到，在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色。以后逐步有一些学者也观察和描述过荧光现象，但对其本质及含义的认识都没有明显的进展。直到1852年，对荧光分析法具有开拓性工作的Stokes在考察奎宁和绿色素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，而不是由光的漫反射引起的，从而导入荧光是光发射的概念，并提出了“荧光”这一术语，他还研究了荧光强度与荧光物质浓度之间的关系，并描述了在高浓度或某些外来物质存在时的荧光猝灭现象。可以说，他是第一个提出应用荧光作为分析手段的人。1867年，Goppelsröde应用铝一桑色素配位化合物的荧光测定铝，这是历史上首次进行的荧光分析工作。第4页，共70页，2023年，2月20日，星期四一、荧光与磷光的产生过程

luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence

由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态

S1、S2…

；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…

；第5页，共70页，2023年，2月20日，星期四

每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能极，而每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外，还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0,M=1,该分子便处于单重态(或叫单重线)，用符号S表示。大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中，不发生自旋方向的变化，这时仍然是M=1，分子处于激发的单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子，即S=1,M=3，分子处于激发的三重态，用符号T表示。2.电子激发态的多重度第6页，共70页，2023年，2月20日，星期四

电子激发态的多重度：M=2S+1

S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；S0→T1

禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；基态激发态单重态激发态三重态激发态平均寿命

10-8sec激发态平均寿命10-4~1secS0S0S0S1T1第7页，共70页，2023年，2月20日，星期四3.激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁

激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～100s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；第8页，共70页，2023年，2月20日，星期四

其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态；T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。第9页，共70页，2023年，2月20日，星期四非辐射能量传递过程:

振动弛豫(Vibrationrelaxation，简写为VR)

：当分子吸收光辐射后可能从基态的最低振动能级(V=0)跃迁到激发单重态Sn(如图中S1、S2)的较高振动能级上。然后，在液相或压力足够高的气相中，分子间的碰撞几率很大，分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围环境，而自身从激发态的高振动能级跃迁至该电子能级的最低振动能级上，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间为10－12s数量级。

内转换(Internalconversion，简写为IC)

：当高电子能级中的低振动能级与低电子能级中的高振动能级发生重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射跃迁形式转移至低电子能级。电子可以通过振动能级的重叠从S2跃迁至S1，或从T2跃迁至T1。这个过程称为内部转移。内部转移的时间为10－11s～10－13s数量级。振动弛豫及内部转移的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以，分子吸收辐射能后不管激发到哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫及内部转移而跃迁到最低(第一)激发单重态的最低振动能级。

第10页，共70页，2023年，2月20日，星期四

外转换(Externalconvertion,EC)

：激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子相互碰撞，并发生能量转移的非辐射跃迁称为外部转移。外部转移能使荧光或磷光的强度减弱甚至消失，这种现象称为“猝灭”或“熄灭”。系间跨越(IntersystemCrossing,ISC)

：指不同多重态之间的无辐射跃迁过程，它涉及到受激发电子自旋状态的改变。如由第一激发单重态S1跃迁至第一激发三重态T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对。这种跃迁是禁阻的(不符合光谱选律)，但如果两个能态的能层有较大重叠时，如中S1的最低振动能级与T1的较高振动能级重叠，就有可能通过自旋一轨道耦合等作用实现这一跃迁。系间跨跃的速度较慢，经历的时间较长。

第11页，共70页，2023年，2月20日，星期四S0S1T1S2紫外可见吸收光谱外转移紫外可见共振荧光光谱内转移荧光系间窜跃磷光反系间窜跃迟滞荧光振动弛豫２.无辐射跃迁的类型振动弛豫:Vr10-12sec外转移:无辐射跃迁回到基态内转移:S2~S1能级之间有重叠系间窜跃:

S2~T1能级之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后T1~

S2１.辐射跃迁的类型共振荧光：10-12sec荧光：10-8sec磷光：1~10-4sec迟滞荧光:102~10-4sec第12页，共70页，2023年，2月20日，星期四辐射能量传递过程:

荧光发射(Fluorescenceemission,FE)

：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为’2的荧光；发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长（为什么？）；第一激发单重态最低振动能级的平均寿命约为10－9～10－4s，因此荧光寿命也在这一数量级。

’2>2>1；

磷光发射(Phosphorescenceemission,PE)

：激发态的电子经系间跨跃后到达激发三重态，经过迅速的振动弛豫而跃迁至第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，这个过程为磷光发射。磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速度很慢。磷光的寿命为10－4～100s。因此，外光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间。由于经过系间跨跃及T1中振动弛豫丢失了一部分能量，所以磷光波长比荧光波长要长，即3>’2

。第13页，共70页，2023年，2月20日，星期四

延迟荧光

T1还可能通过热激发而重新跃回S1

即T1→

S1，然后再由S1经辐射跃迁回S0，即S1→S0，发出荧光，这种荧光称为延迟荧光，其寿命与磷光相近，但波长比磷光短。第14页，共70页，2023年，2月20日，星期四一、激发（吸收）光谱与荧光(磷光)光谱（发射）

excitationspectrumandfluore-scencespectrum1.荧光(磷光)的激发光谱曲线

固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。

激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；

荧光和磷光均属于光致发光，所以都涉及到两种辐射，即激发光(吸收)和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。它们是荧光和磷光定性和定量分析的基本参数及依据。照射光波长如何选择？

第二节分子荧光和磷光分析法第15页，共70页，2023年，2月20日，星期四2.荧光光谱(或磷光光谱)

固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。

通过激发光谱，选择最佳激发波长——发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常用λex表示。通过发射光谱选择最佳的发射波长——发射荧光(磷光)强度最大的发射波长，常用λem表示。磷光发射波长比荧光来得长

第16页，共70页，2023年，2月20日，星期四第17页，共70页，2023年，2月20日，星期四3.激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。

b.发射光谱的形状与激发波长无关；荧光激发光谱的形状与发射波长无关

电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如’2)c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。第18页，共70页，2023年，2月20日，星期四镜像规则的解释

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似

假如吸收时由S0的V=0与第一激发态S1的V=2之间的跃迁几率最大(即强度最大)，那么在荧光发射时，由S1的V=0跃回S0的V=2的几率也应该最大，如图所示。基于上述原因，荧光发射光谱与吸收光谱之间显现镜像对称关系第19页，共70页，2023年，2月20日，星期四200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱第20页，共70页，2023年，2月20日，星期四二、荧光的产生与分子结构的关系

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；a.具有π-π＊电子跃迁类型的结构

b.具有大的共轭π键结构

（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：

荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；第21页，共70页，2023年，2月20日，星期四2.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。又如芴与联二苯，由于芴中的亚甲基使分子的刚性平面增加，导致两者在荧光性质上的显著差别，前者荧光产率接近于1，后者仅为0.18。萘与维生素A都具有5个共轭π键，而前者为平面结构，后者为非刚性结构，因而前者的荧光强度为后者的5倍。

（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。影响规律多出自实验总结和推测第22页，共70页，2023年，2月20日，星期四第23页，共70页，2023年，2月20日，星期四第24页，共70页，2023年，2月20日，星期四取代基的影响主要有以下几个方面：1、给电子取代基使荧光加强2、吸电子基团使荧光减弱而磷光增强3、取代基位置的影响取代基位置对芳烃荧光的影响通常为：邻位，对位取代者增强荧光，间位取代者抑制荧光(－CN取代基例外)。取代基的空间阻碍对荧光也有明显的影响。如化合物萘环上的8位引入－SO3－基时，由于空间阻碍使－NR2与萘之间的键扭转而减弱了平面构型，影响了p～π共轭，导致荧光的减弱。同样，1,2－二苯乙烯的反式异构体是强荧光物质，而顺式异构体不发射荧光。4、重原子效应

荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。所谓重原子取代，一般指的是卤素(Cl、Br和I)原子取代

第25页，共70页，2023年，2月20日，星期四三、影响荧光强度的因素

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure

影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液pH

对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；第26页，共70页，2023年，2月20日，星期四4.内滤光作用和自吸现象

自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。

内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；第27页，共70页，2023年，2月20日，星期四5.溶液荧光的猝灭

荧光的猝灭(熄灭)一词，从广义上说，指的是任何可使某给定荧光物质的荧光强度降低的作用，或者任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用。从狭义上说，指的是荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子之间的相互作用，导致荧光强度降低的现象。与荧光物质发生相互作用而使荧光强度降低的物质，称为猝灭剂。荧光猝灭的形式很多，机理也比较复杂。主要有如下几种类型:碰撞猝灭生成化合物的猝灭能量转移猝灭氧的猝灭转入三重态的猝灭荧光物质的自猝灭第28页，共70页，2023年，2月20日，星期四四、荧光分析仪

荧光分析仪器与紫外-可见分光光度计的基本组成部件相同，即有：光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置五个部分。第29页，共70页，2023年，2月20日，星期四1、仪器结构流程

测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器、记录显示系统。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。

基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：氙灯、钨卤素灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。第30页，共70页，2023年，2月20日，星期四第31页，共70页，2023年，2月20日，星期四仪

器

光

路

图第32页，共70页，2023年，2月20日，星期四仪器框图该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；第33页，共70页，2023年，2月20日，星期四同步扫描技术

根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种；

同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；如图。合适的可减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但<15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱；>60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定第34页，共70页，2023年，2月20日，星期四可获得三维光谱图的仪器

可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图第35页，共70页，2023年，2月20日，星期四磷光检测荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量（采用低温磷光分析法，即试样溶液需要低温冷冻）。在有荧光发射的同时测量磷光。

测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶(盛有液氮

)。第36页，共70页，2023年，2月20日，星期四五、荧光分析方法与应用1.特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级检测下限：0.1～0.001

μg·mL－1

其一，荧光强度正比于入射光的强度，所以增大光源的强度可以提高灵敏度，降低检测限；其二，荧光的测量是在激发光的垂直方向检测的，即在暗背景中检测，所以只要较好地消除杂散光，采用较灵敏的检测器，很微弱的荧光都可以检测，所以检测限较低。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少缺点：应用范围小。第37页，共70页，2023年，2月20日，星期四

用检测限来表示荧光法的灵敏度，在实际工作中是比较直观和方便的。荧光分析法的检测限可以有两种表示方法：一是以喹宁表示，在0.05mol·L－1硫酸中，喹宁的荧光峰为450nm，当喹宁溶液很稀（如0.05μg·L－1）时，溶剂的拉曼峰所造成的对喹宁荧光信号的噪声已相当显著。因此人们常以此时喹宁信号与仪器噪声之比的喹宁浓度定为该仪器的检测灵敏度。多数仪器的检测灵敏度为0.05μg·L－1喹宁，有些灵敏度高的仪器可达0.005μg·L－1喹宁；二是以水的拉曼光信噪比表示，当水分子被激发时，水分子蒙受暂时的畸变，在极短的时间内（10－12－10－15s），会向各个方向发射出与激发光波长相等的瑞利光和波长略长的拉曼光。通过测量拉曼光的信噪比可以衡量仪器的检测灵敏度。由于纯的水易得，用同一波长的光激发水分子所产生的拉曼光波长一样，便于检测，所以用拉曼光信噪比表示仪器的灵敏度已为较多的产家所采用。第38页，共70页，2023年，2月20日，星期四★常规分析应用：

☆定性分析：φf；λex；λem；峰形等

☆定量检测：

F=K﹒I0﹒φf﹒C

☆其它（略）★高端生化研究：

☆分子相互作用研究；☆代谢动力学跟踪；☆显微成像（物理迁移与化学衍化的原位“显迹”）第39页，共70页，2023年，2月20日，星期四2.定量依据与方法(1)定量依据

荧光强度

If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：

If=Ia

由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)

浓度很低时，将括号项近似处理后：

If=2.3I0lc

=Kc第40页，共70页，2023年，2月20日，星期四（2）定量方法标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；第41页，共70页，2023年，2月20日，星期四3.荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析第42页，共70页，2023年，2月20日，星期四第43页，共70页，2023年，2月20日，星期四第44页，共70页，2023年，2月20日，星期四4、磷光分析法的应用（1）稠环芳烃分析

采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表（2）农药、生物碱、植物生长激素的分析

烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析检测限0.01g/cm-3

（3）药物分析和临床分析

见表第45页，共70页，2023年，2月20日，星期四第46页，共70页，2023年，2月20日，星期四第47页，共70页，2023年，2月20日，星期四第三节化学发光

由于化学反应产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量产生光子，从而导致的发光现象。化学发光分析仪

美国MD公司型号

LmaxII/II384检测器：光子计数器

第48页，共70页，2023年，2月20日，星期四按化学反应类型酶促化学发光：辣根过氧化物酶系统碱性磷酸酶系统黄嘌呤氧化酶系统非酶促化学发光：

吖啶酯系统草酸酯系统三价铁-鲁米诺系统闪光（Flash）:按发光持续时间发光时间在数十分钟以上，如：

HRP-Luminol系统

AP-AMPPD系统黄嘌呤氧化酶系统无须原位进样、以速率法测量。发光时间在数秒内，如吖啶酯以原位进样(InSituInjector)和时间积分法测量辉光（Glow）:化学发光的分类第49页，共70页，2023年，2月20日，星期四免疫测定

是利用抗原抗体反应来测定标本中微量物质的方法。化学发光反应参与的免疫测定分为二种类型第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的敏感性；第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。第50页，共70页，2023年，2月20日，星期四化学发光免疫分析目前分类

按发光剂不同分为

1.发光酶免疫测定技术（CLEIA）

2.化学发光免疫测定技术(CLIA)

3.电化学发光免疫测定技术(ECLIA)escenceimmunoassay第51页，共70页，2023年，2月20日，星期四几种标记免疫技术灵敏度的比较酶标荧光放免发光灵敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9第52页，共70页，2023年，2月20日，星期四临床应用广1）甲状腺激素2）生殖激素3）肾上腺/垂体激素4）贫血因子5）肿瘤标记物6）感染性疾病7）糖尿病8）心血管系统9）病毒标记物10）骨代谢11）过敏性疾病12）治疗药物监测第53页，共70页，2023年，2月20日，星期四1、在分子荧光法中，以下说法中正确的是（）（1）激发过程中的电子自旋虽不变，但激发态已不是单重态（2）激发态电子的自旋不成对，此状态称为单重态（3）激发三重态能级比相应激发单重态能级要低一些（4）单重态到三重态的激发概率高于单重态到单重态2、在分子荧光分析法中，下面说法正确的是 （）（1）荧光发射光谱不随激发波长的变化而改变（2）荧光发射光谱要随激发波长的变化而改变（3）荧光激发光谱与它的紫外－可见吸收光谱互为镜像对称关系（4）荧光发射光谱与它的紫外－可见吸收光谱形状相似且波长位置也一样3、紫外-可见分光光度计与荧光分光光度计结构上的两个最主要差别是

____________________________和____________________________________。4、下列哪一种分子的去激发过程是荧光过程?()(1)分子从第一激发单重态的最低振动能级返回到基态(2)分子从第二激发单重态的某个低振动能级过渡到第一激发单重态(3)分子从第一激发单重态非辐射跃迁至三重态(4)分子从第一激发三重态的最低振动能级返回到基态第54页，共70页，2023年，2月20日，星期四1、在分子荧光法中，以下说法中正确的是（）（1）激发过程中的电子自旋虽不变，但激发态已不是单重态（2）激发态电子的自旋不成对，此状态称为单重态

（3）激发三重态能级比相应激发单重态能级要低一些（4）单重态到三重态的激发概率高于单重态到单重态2、在分子荧光分析法中，下面说法正确的是 （）（1）荧光发射光谱不随激发波长的变化而改变（2）荧光发射光谱要随激发波长的变化而改变（3）荧光激发光谱与它的紫外－可见吸收光谱互为镜像对称关系（4）荧光发射光谱与它的紫外－可见吸收光谱形状相似且波长位置也一样3、紫外-可见分光光度计与荧光分光光度计结构上的两个最主要差别是

____________________________和____________________________________。4、下列哪一种分子的去激发过程是荧光过程?()(1)分子从第一激发单重态的最低振动能级返回到基态(2)分子从第二激发单重态的某个低振动能级过渡到第一激发单重态(3)分子从第一激发单重态非辐射跃迁至三重态(4)分子从第一激发三重态的最低振动能级返回到基态第55页，共70页，2023年，2月20日，星期四1、在分子荧光法中，以下说法中正确的是（）（1）激发过程中的电子自旋虽不变，但激发态已不是单重态（2）激发态电子的自旋不成对，此状态称为单重态

（3）激发三重态能级比相应激发单重态能级要低一些（4）单重态到三重态的激发概率高于单重态到单重态2、在分子荧光分析法中，下面说法正确的是 （）

（1）荧光发射光谱不随激发波长的变化而改变（2）荧光发射光谱要随激发波长的变化而改变（3）荧光激发光谱与它的紫外－可见吸收光谱互为镜像对称关系（4）荧光发射光谱与它的紫外－可见吸收光谱形状相似且波长位置也一样3、紫外-可见分光光度计与荧光分光光度计结构上的两个最主要差别是

____________________________和____________________________________。4、下列哪一种分子的去激发过程是荧光过程?()(1)分子从第一激发单重态的最低振动能级返回到基态(2)分子从第二激发单重态的某个低振动能级过渡到第一激发单重态(3)分子从第一激发单重态非辐射跃迁至三重态(4)分子从第一激发三重态的最低振动能级返回到基态第56页，共70页，2023年，2月20日，星期四1、在分子荧光法中，以下说法中正确的是（）（1）激发过程中的电子自旋虽不变，但激发态已不是单重态（2）激发态电子的自旋不成对，此状态称为单重态

（3）激发三重态能级比相应激发单重态能级要低一些（4）单重态到三重态的激发概率高于单重态到单重态2、在分子荧光分析法中，下面说法正确的是 （）

（1）荧光发射光谱不随激发波长的变化而改变（2）荧光发射光谱要随激发波长的变化而改变（3）荧光激发光谱与它的紫外－可见吸收光谱互为镜像对称关系（4）荧光发射光谱与它的紫外－可见吸收光谱形状相似且波长位置也一样3、紫外-可见分光光度计与荧光分光光度计结构上的两个最主要差别是

_后者的光源与检测器方向互相垂直

__和_____后者有两个单色器_______。4、下列哪一种分子的去激发过程是荧光过程?()(1)分子从第一激发单重态的最低振动能级返回到基态(2)分子从第二激发单重态的某个低振动能级过渡到第一激发单重态(3)分子从第一激发单重态非辐射跃迁至三重态(4)分子从第一激发三重态的最低振动能级返回到基态第57页，共70页，2023年，2月20日，星期四1、在分子荧光法中，以下说法中正确的是（）（1）激发过程中的电子自旋虽不变，但激发态已不是单重态（2）激发态电子的自旋不成对，此状态称为单重态

（3）激发三重态能级比相应激发单重态能级要低一些（4）单重态到三重态的激发概率高于单重态到单重态2、在分子荧光分析法中，下面说法正确的是 （）

（1）荧光发射光谱不随激发波长的变化而改变（2）荧光发射光谱要随激发波长的变化而改变（3）荧光激发光谱与它的紫外－可见吸收光谱互为镜像对称关系（4）荧光发射光谱与它的紫外－可见吸收光谱形状相似且波长位置也一样3、紫外-可见分光光度计与荧光分光光度计结构上的两个最主要差别是

_后者的光源与检测器方向互相垂直

__和_____后者有两个单色器_______。4、下列哪一种分子的去激发过程是荧光过程?()(1)分子从第一激发单重态的最低振动能级返回到基态(2)分子从第二激发单重态的某个低振动能级过渡到第一激发单重态(3)分子从第一激发单重态非辐射跃迁至三重态(4)分子从第一激发三重态的最低振动能级返回到基态第58页，共70页，2023年，2月20日，星期四5、当浓度很低时,物质的荧光强度与其浓度________________________,在较高浓度时,荧光强度将随浓度的增高而________________________。6、受激气态原子直接跃回高于基态的亚稳态时发射的荧光称_________________,受激气态原子以非辐射形式失去部分能量回到较低激发态,然后跃回基态时产生的荧光称________________。7、分子磷光的发光速率___________,磷光的平均寿命比荧光_______,在光照停止后____________________。8、当激发态分子由第一电子激发态的___________,以光辐射形式释放能量降落到基态的各个振动和转动能级时,基态振动和转动能级越_______,所发射荧光的波长越_______。9、分子荧光的发射过程是分子中的价电子吸收辐射能之后,跃迁到高电子激发态的任一振动能级,然后通过_____________,降落到激发态的___________________,最后发射出一个光子而回到基态。10、分子荧光是_________________________________________发出的光.发光时间较短;而磷光是_________________________________________发出的光,发光时间较长。第59页，共70页，2023年，2月20日，星期四5、当浓度很低时,物质的荧光强度与其浓度____呈正比

_________,在较高浓度时,荧光强度将随浓度的增高而_____

降低

____________。6、受激气态原子直接跃回高于基态的亚稳态时发射的荧光称_________________,受激气态原子以非辐射形式失去部分能量回到较低激发态,然后跃回基态时产生的荧光称________________。7、分子磷光的发光速率___________,磷光的平均寿命比荧光_______,在光照停止后____________________。8、当激发态分子由第一电子激发态的___________,以光辐射形式释放能量降落到基态的各个振动和转动能级时,基态振动和转动能级越_______,所发射荧光的波长越_______。9、分子荧光的发射过程是分子中的价电子吸收辐射能之后,跃迁到高电子激发态的任一振动能级,然后通过_____________,降落到激发态的___________________,最后发射出一个光子而回到基态。10、分子荧光是_________________________________________发出的光.发光时间较短;而磷光是_________________________________________发出的光,发光时间较长。第60页，共70页，2023年，2月20日，星期四5、当浓度很低时,物质的荧光强度与其浓度____呈正比

_________,在较高浓度时,荧光强度将随浓度的增高而_____

降低

____________。6、受激气态原子直接跃回高于基态的亚稳态时发射的荧光称__直跃线荧光

__,受激气态原子以非辐射形式失去部分能量回到较低激发态,然后跃回基态时产生的荧光称_阶跃线荧光

____。8、当激发态分子由第一电子激发态的___________,以光辐射形式释放能量降落到基态的各个振动和转动能级时,基态振动和转动能级越_______,所发射荧光的波长越_______。9、分子荧光的发射过程是分子中的价电子吸收辐射能之后,跃迁到高电子激发态的任一振动能级,然后通过_____________,降落到激发态的___________________,最后发射出一个光子而回到基态。10、分子荧光是_________________________________________发出的光.发光时间较短;而磷光是_________________________________________发出的光,发光时间较长。7、分子磷光的发光速率___________,磷光的平均寿命比荧光_______,在光照停止后____________________。第61页，共70页，2023年，2月20日，星期四5、当浓度很低时,物质的荧光强度与其浓度____呈正比

_________,在较高浓度时,荧光强度将随浓度的增高而_____

降低

____________。6、受激气态原子直接跃回高于基态的亚稳态时发射的荧光称__直跃线荧光

__,受激气态原子以非辐射形式失去部分能量回到较低激发态,然后跃回基态时产生的荧光称_阶跃线荧光

____。7、分子磷光的发光速率__较慢

____,磷光的平均寿命比荧光__长

___,在光照停止后_还可以保持发射磷光一段时间

_。8、当激发态分子由第一电子激发态的___________,以光辐射形式释放能量降落到基态的各个振动和转动能级时,基态振动和转动能级越_______,所发射荧光的波长越_______。9、分子荧光的发射过程是分子中的价电子吸收辐射能之后,跃迁到高电子激发态的任一振动能级,然后通过_____________,降落到激发态的___________________,最后发射出一个光子而回到基态。10、分子荧光是_________________________________________发出的光.发光时间较短;而磷光是_________________________________________发出的光,发光时间较长。第62页，共70页，2023年，2月20日，星期四5、当浓度很低时,物质的荧光强度与其浓度____呈正比

_________,在较高浓度时,荧光强度将随浓度的增高而_____

降低

____________。6、受激气态原子直接跃回高于基态的亚稳态时发射的荧光称__直跃线荧光

__,受激气态原子以非辐射形式失去部分能量回到较低激发态,然后跃回基态时产生的荧光称_阶跃线荧光

____。7、分子磷光的发光速率__较慢

____,磷光的平均寿命比荧光__长

___,在光照停止后_还可以保持发射磷光一段时间

_。8、当激发态分子由第一电子激发态的最低振动、转动能极

,以光辐射形式释放能量降落到基态的各个振动和转动能级时,基态振动和转动能级越_高

__,所发射荧光的波长越_长

__。9、分子荧光的发射过程是分子中的价电子吸收辐射能之后,跃迁到高电子激发态的任一振动能级,然后通过_____________,降落到激发态的___________________,最后发射出一个光子而回到基态。10、分子荧光是_________________________________________发出的光.发光时间较短;而磷光是_________________________________________发出的光,发光时间较长。第63页，共70页，2023年，2月20日，星期四5、当浓度很低时,物质的荧光强度与其浓度____呈正比

_________,在较高浓度时,荧光强度将随浓度的增高而_____

降低

____________。6、受激气态原子直接跃回高于基态的亚稳态时发射的荧光称__直跃线荧光

__,受激气态原子以非辐射形式失去部分能量回到较低激发态,然后跃回基态时产生的荧光称_阶跃线荧光

____。7、分子磷光的发光速率__较慢

____,磷光的平均寿命比荧光__长

___,在光照停止后_还可以保持发射磷光一段时间

_。8、当激发态分子由第一电子激发态的最低振动、转动能极

,以光辐射形式释放能量降落到基态的各个振动和转动能级时,基态振动和转动能级越_高

__,所发射荧光的波长越_长

__。9、分子荧光的发射过程是分子中的价电子吸收辐射能之后,跃迁到高电子激发态的任一振动能级,然后通过_振动弛豫和内转换（或非辐射跃迁）

_,降落到激发态的_最低振动能极

_,最后发射出一个光子而回到基态。10、分子荧光是_________________________________________发出的光.发光时间较短;而磷光是_________________________________________发出的光,发光时间较长。第64页，共70页，2023年，2月20日，星期四5、当浓度很低时,物质的荧光强度与其浓度____呈正比

_________,在较高浓度时,荧光强度将随浓度的增高而_____

降低

____________。6、受激气态原子直接跃回高于基态的亚稳态时发射的荧光称__直跃线荧光

__,受激气态原子以非辐射形式失去部分能量回到较低激发态,然后跃回基态时产生的荧光称_阶跃线荧光

____。7、分子磷光的发光速率__较慢

____,磷光的平均寿命比荧光__长

___,在光照停止后_还可以保持发射磷光一段时间

_。8、当激发态分子由第一电子激发态的最低振动、转动能极

,以光辐射形式释放能量降落到基态的各个振动和转动能级时,基态振动和转动能级越_高

__,所发射荧光的波长越_长

__。9、分子荧光的发射过程是分子中的价电子吸收辐射能之后,跃迁到高电子激发态的任一振动能级,然后通过_振动弛豫和内转换（或非辐射跃迁）

_,降落到激发态的_最低振动能极

_,最后发射出一个光子而回到基态。10、分子荧光是____电子由受激发单重态返回基态

_____________发出的光.发光时间较短;而磷光是______电子由受激发三重态返回基态

________发出的光,发光时间较长。第65页，共70页，2023年，2月20日，星期四11、分子荧光的发射波长比激发波长大或者小？为什么？A．大；因为去激发过程中存在各种形式的无辐射跃迁，损失一部分能量；B．小；因为激发过程中，分子吸收一部分外界能量；C．相同；因为激发和发射在同样的能级上跃迁，只是过程相反；D．不一定；因为其波长的大小受到测量条件的影响。12、在分子荧光测量中，要使荧光强度正比于荧光物质的浓度，必要的条件是什么？

A．

用高灵敏的检测器

B．在最大的量子产率下测量

C．在最大的摩尔吸光系数下测量；

D．在稀溶液中测量。

13、下列说法中，正确的是哪一个？

A．能发荧光的物质一般具有杂环化合物的刚性结构；

B．能发荧光的物质一般具有大环化合物的刚性结构；

C．能发荧光的物质一般具有对称性质的环状结构；D．能发荧光的物质一般具有π－π共轭体系的刚性结构；

14、在下列的四种说法中，哪一种是不正确的？

A．分子荧光发射光谱通常与吸收光谱互为镜像关系；

B．分子荧光发射光谱与激发波长没有关系；

C．分子荧光发射光谱随激发波长不同而变化；

D．分子荧光发射的强度与激发光的强度成正比的关系。

第66页，共70页，2023年，2月20日，星期四11、分子荧光的发射波长比激发波长大或者小？为什么？A．大；因为去激发过程中存在各种形式的无辐射跃迁，损失一部分能量；B．小；因为激发过