光学显微镜课件完整版

1.7偏光显微镜双目偏光显微镜三目偏光显微镜三目数码偏光显微镜1.7偏光显微镜物质发出的光波具有一切可能的震动方向,且各方向振动矢量的大小相等,称为叫自然光。

偏振光:与自然光不同,当光矢量在一个固定的平面内只沿一个固定方向作振动时,这种光称为偏振光.自然光通过偏振棱镜或人造偏振片可获得偏振光.利用偏光原理,可对某些物质具有的偏光性进行观察的显微镜,就称为偏光显微镜.定义:

1.7.1偏光显微镜的特点1.7偏光显微镜

将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同性）或双折射性（各向异性）。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域，在生物学和植物学也有应用。

★晶体的双折射有些透明媒质，如玻璃、水、肥皂液等，不论光沿哪个方向，传播速度都是相同的，媒质只有一个折射率，这样的媒质称为光学各向同性媒质。同时还存在另一类媒质，主要是透明晶体物质，如方解石(化学成分是CaCO3)、石英、云母、硫磺等，光在其中传播时，沿着不同方向有不同的传播速率，这样的媒质称为光学各向异性媒质。

光在晶体中的双折射现象就是光学各向异性的表现。★双折射现象

光线进入光学各向异性媒质(如方解石)后产生两条折射光线的现象，称为双折射现象。天然的方解石晶体是双折射晶体AB

晶体中的双折射现象方解石···oe···eo

以入射线为轴转方解石，光点o不动，e绕o转，用偏振片检验，二者都是偏振光，且偏振方向互相垂直。所以，利用双折射现象也可以获得线偏振光。

产生双折射的原因:o光和e光的传播速度不同。

o光在晶体中各个方向的传播速度相同，因而折射率no=c/o=恒量。

e光在晶体中的传播速度e随方向变化，因而折射率ne=c/e是变量，随方向变化。

由于o光和e光的折射率不同，故产生双折射。1.7偏光显微镜1.7.2偏光显微镜结构

偏光显微镜结构示意图在一般大型显微镜光路中，只要加入两偏振片即可，即在入射光路中加入一个起偏振片，在观察镜筒中加入一个检偏振片，就可以实现偏振光照明。起偏镜:一般安装在可以转动的圆框内，借助手柄转动调节;作用是把来自光源的自然光变成偏振光;检偏镜:作用是分辨被偏振光照射于金属磨面后出射光的偏振状态.

1.7.3偏光装置的调整1.7偏光显微镜(1)起偏镜位置的调整调节的目的—使入射光的偏振面呈水平位置，以保证从垂直照明器平面玻璃反射进入物镜的偏振光强度最大，且仍为直线偏振光。调整方法—将经过抛光而未经腐蚀的不锈钢试样(光性均质体)放在载物台上，除去检偏镜，只装起偏振镜，从目镜内观察聚焦后试样磨面上反射光的强度，转动起偏镜，反射光强度发生明暗变化，当反射光最强时，就是起偏振镜振动轴的正确位置。

(2)检偏镜位置的调整1.7偏光显微镜起偏镜置于正确位置后，插入检偏镜，检偏镜可在90°内调整，以通过目镜观察偏振光的强弱。(3)校正载物台中心位置调整方法—载物台机械中心应与光学系统主轴重合。一般是通过载物台上的对中螺钉进行调整。调节的目的—为使观察目标在载物台旋转时不离开视域。在偏振光下研究金相磨面，一般只需抛光而不需浸蚀，与其它金相研究方法相比有如下特点：（1）组织显示清楚，如铀、铍等金相试样

；（2）适合于在高温下连续观察金相组织的变化。如锌的再结晶，铀铬合金的马氏体相变；（3）能清晰地显示经过大量范性变形后金属的金相组织；（4）能测定晶粒的位向及多晶体范性变形后的择优取向；（5）能鉴别复相合金中的各相。1.7偏光显微镜1.7.4偏光显微镜的应用

1.7.4偏光显微镜的应用

1.7偏光显微镜A、组织与晶粒的显示各向异性金属的多晶体，其晶粒在正交偏振光下可看到不同亮度。亮度不同，表明晶粒位相不同，而具有相同亮度的两个晶粒，有相同的位相。例如：球墨铸铁的组织中的石墨属于六方点阵，是各向异性的物质，在同一石墨球中具有许多不同位向的石墨晶粒，这些石墨晶粒在偏振光下可显示不同的亮度，从而分辨出石墨晶粒的方位、球状和大小。

球墨铸铁的显微组织（a）30°偏光照片

（b）明场照片

B、多相合金的相分析1.7偏光显微镜两相合金中一相为各相同性，另一相为各相异性，极易由偏振光鉴别。

两相都属于各相同性，经适当的化学浸蚀后，使一相被浸蚀后具有光学各相异性，而另一相并不发生浸蚀作用。例如：55SiMnMo钢，正火后组织为马氏体加贝氏体，因马氏体较贝氏体难于被浸蚀，故经4%的硝酸酒精浸蚀后，贝氏体形成倾斜的晶面，在正交偏振光下倾斜的晶面将引起椭圆偏振，故可观察到明暗不同的贝氏体；因马氏体未被浸蚀，它不能引起椭圆偏振，呈一片黑暗。1.7偏光显微镜C、非金属夹杂物的鉴定金属中长存在各种类型的非金属夹杂物，它们具有各种光学特性，如反射能力、透明度、非均质性等。利用偏振光可观察到这些夹杂物的特性，如鉴别钢中非金属夹杂物。钢中SiO2玻璃球夹杂物

（a）明场照明（b）正交偏光照明例如：各向同性的球形透明夹杂物在正交偏振光下会呈现“黑十字”现象。1.8荧光显微镜经0.01%的丫啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光（暗绿色和橙红色）1.8荧光显微镜

1.8.1荧光显微镜成像原理荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。广泛应用于生物、医学等技术领域。基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。尼康E800荧光DIC显微镜1.8.2荧光显微镜基本构造1.8荧光显微镜它是由普通光学显微镜加上一些附件（荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等）组成的。

（1）荧光光源

―般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。（2）激发滤片放置的原因：由于每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以加用激发滤片仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其它光都吸收掉。

★激发滤片分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤片，亮视野可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。

1.8荧光显微镜★激发滤片：一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片；激发滤板

根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。紫外光激发滤板：可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。紫外蓝光激发滤板：可使300～450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。紫蓝光激发滤板：可使350～490nm的光通过。常用型号为QB24（BG12）。1.8荧光显微镜1.8荧光显微镜（3）阻断（压制）滤片阻断滤片的作用：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛;二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。压制滤板

与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板：紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤长的荧光（绿到红）。紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的荧光（蓝到红）。1.8荧光显微镜1.8荧光显微镜1.8.3荧光显微镜按光路的分类(1)透射式荧光显微镜

激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．是比较旧式的荧光显微镜。优点—低倍镜时荧光强；缺点—随放大倍数增加其荧光减弱．

所以对观察较大的标本材料较好．落射式荧光显微镜A—载物台；H—汞灯.B—标本；C—物镜；D—双色束分离器；E—激发滤片；F—阻断滤片；G—目镜；(２)落射式荧光显微镜

1.8荧光显微镜1.8荧光显微镜(２)落射式荧光显微镜

★激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光轴呈45度角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。★优点：视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。★换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。1.8荧光显微镜1.8荧光显微镜1.8.4使用注意事项（１）打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮；（２）落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块；（３）用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央；（6）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。（４）放置标本片，调焦后即可观察；（５）观察：标本内的荧光染色会较快的衰减，所以要避免长时间的在荧光下观察。1.8荧光显微镜1.8荧光显微镜注意：激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光；

末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。1.8荧光显微镜荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）1.9相衬金相及微差干涉衬度

相衬显微术：就是在显微镜中利用一种特殊的光学装置来提高物相反差（衬度）的方法。在生物学方面获得了更广泛的应用。对于不能有效地腐蚀出显微组织的金相，就可以用相衬方法。

例题：1.过共析钢球化退火，渗碳体呈颗粒状分布在铁素体基体上。因在常用的硝酸酒精溶液腐蚀下，铁素体的溶解速度要比渗碳体快，因此，渗碳体颗粒凸起在铁素体基体上。由于铁素体和渗碳体对于光的反射能力相近，则采用相衬方法，渗碳体是明亮的，而铁素体基体是暗灰色的。1.9相衬金相及微差干涉衬度2.高速钢刀具热处理时，通常要检查其淬火组织，主要为了测定奥氏体的实际晶粒度，以判断淬火加热温度是否合适；其次还要看碳化物的熔解是否充分，这也是与淬火加热温度直接有关的。在明视场条件下，残余奥氏体晶界比较清晰，因此不难评定其晶粒度级别。但是，由于碳化物也是明亮的颗粒，其中一些较大的一次碳化物，不容易和基体分开，因此在判定碳化物的熔解是否充分时就有一定的困难。在相衬照明条件下，碳化物颗粒凸起，因此是明亮的，而基体则是灰暗的。其中奥氏体晶界仍部分隐约可见，碳化物与基体之间具有良好的反差，因此很容易看出碳化物的数量及其分布情况。1.9相衬金相及微差干涉衬度微差干涉衬度（简称DIC，differentialinterferencecontrast）是近年来发展的有效方法之一。DIC是将试样表面微小高度差所造成的光程差，利用一套特殊的光学装置转变成为人眼及感光材料能感受的强度差，从而提高组织细节之间的衬度，使之易于识别。微差干涉可以观察到表面高度差只有几个埃的纤维组织。目前多利用微差干涉衬度观察不经腐蚀的相变组织、干涉层金相等。1.9相衬金相及微差干涉衬度微差干涉衬度的应用：（1）利用不同相呈现不同色彩的特点，可以作为相鉴别的佐证，特别适合于复杂的合金组织；（2）提高衬度，能显示一般明场观察不到的某些组织细节；（3）获得衬度良好的图像，适于做自动定量工作；（4）在晶体生长、矿物鉴别、高温显微技术方面具有广泛的用途。1.9相衬金相及微差干涉衬度例题：成分复杂或凝固温度范围大的铸造合金。由于不同合金元素富集区的溶解度不同，试样表面就会产生微小的高度差。1.10定量金相

定量金相的基础是体视学(Stereology)。从二维截面定量地推导出存在于三维空间的组织，逐渐形成一门横跨几个学