丝氨酸蛋白酶水解机制课件_第1页
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4.4.5丝氨酸蛋白酶水解机制什么是丝氨酸蛋白酶？丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，其激活是通过活性中心一组氨基酸残基变化实现的，它们之中一定有一个是丝氨酸（Ser，serine）。在哺乳类动物里面，丝氨酸蛋白酶扮演着很重要的角色，特别是在消化，凝血和补体系统方面。最典型的三种丝氨酸蛋白酶：胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶同属消化酶系，在胰腺泡内合成并分泌到十二指肠中。均可催化肽键的水解反应，但对肽键的选择性则有所不同这一反应过程具有两相特征：快速反应相：对硝基苯酚离子快速形成，与酶的浓度成正比。恒态反应相：对硝基苯酚离子形成较缓慢，形成速率恒定。（决定反应速率的关键步骤）快速反应相过程中酶和底物结合释放出对硝基苯酚离子，同时形成乙酰基-酶中间体；而恒态反应相过程则是乙酰基-酶中间体缓慢水解，放出酶，使之与底物相结合继续释放出对硝基苯酚离子。由于乙酰基-酶的水解很慢，使体系中酶浓度下降，进而导致对硝基苯酚释放速率变慢。2.酶活化中心必需基团的测定(1)活性Ser基团：二异丙基磷酰氯（DIPF）能特异性与Ser基团的-OH反应，其结果导致作为酶活性中心的Ser的残基发生不可逆失活，此方法可有效确定胰凝乳蛋白酶中的Ser-195是酶活性中心必需氨基酸残基。

DIPF作用于动物上时，即可显示出很高的神经毒性，动物体内的乙酰胆碱酯酶（丝氨酸蛋白水解酶的一种）能够与DIPF反应，使其自身失活，失去对乙酰胆碱的水解作用。乙酰胆碱是一种生物体内常见的神经传导物质，自身具有很高的毒性，而负责水解完成传递信息任务后的乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶（乙酰胆碱酯酶可将乙酰胆碱分解成无毒性的乙酸和胆碱）失活之后就会导致乙酰胆碱在生物体内不断地积累，最终导致生物中毒死亡。(3)丝氨酸蛋白水解酶的空间结构：X射线衍射法：通常，都是将表达蛋白的基因PCR之后克隆到一种表达载体中，然后在大肠杆菌中诱导表达，提纯之后摸索结晶条件。结晶后，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。牛的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及住的弹性蛋白酶在结构上很相似，这三种酶大约由240个氨基酸残基组成，三者的一级结构大约有40%是相同的，且活性中心的必需氨基酸也大致相同（Ser、His、Asp）3.催化作用机制（1）结构特性

以胰凝乳蛋白酶举例，其活性中心有三个必需氨基酸残基：Ser-195，His-57和Asp-102，这三部分通过氢键结合，整体呈三角形，即所谓的“催化三元区”。“催化三元区”的最显著特征是Ser-195的羟基高度极化，具有很高的亲核进攻能力。（2）亲核共价催化作用——易形成四联体结构的中间物Step1：Ser-195作用于底物的肽键酰基，发起亲核进攻，形成一个包括Ser-195的羟基、底物酰基和氨基在

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