高效液相色谱分离检测技术

1、固定相（柱填料）

常用填料基质可分为硅胶、氧化物和聚合物。

硅胶是HPLC填料中最常用的基质。它具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好的化学稳定性和热稳定性以及专一的表面化学反应等优点外，还有一个突出的优点就是其表面含有丰富的硅羟基，这是硅胶可以进行表面键合或改性的基础。

缺点：在碱性水溶性流动相中不稳定。4.4.1液谱分离系统目前市场主要可供选择的硅胶填料粒径1.7μm，1.8μm，2.2μm－快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪2.7μm－多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo)3.0μm，3.5μm－普通快速分析5.0μm－常规分析颗粒越小，柱效越高，但是耐污染性能下降，柱压升高。现在是1页\一共有33页\编辑于星期六

1.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体

氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。

（2）表面多孔型担体

（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底。现在是2页\一共有33页\编辑于星期六4.4.1液谱分离系统HPLC固定相状态分液-固色谱法（LSC）液-液色谱法（LLC）分离机制分吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法分子排阻色谱法化学键合相色谱法亲合色谱法离子色谱法现在是3页\一共有33页\编辑于星期六一、化学键合相色谱法化学键合相（chemicallybondedphase）将固定液（含不同官能团的有机分子）利用化学反应键合到载体表面上，使其形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相1．键合相类型载体-----硅胶类型非极性固定相(ODS）极性键合相（键合-NH2、-CN、醇基等极性基团）

离子型键合相（键合可交换阴或阳离子基团)键合反应---硅烷化反应、硅酸酯化反应现在是4页\一共有33页\编辑于星期六2．分离原理（1）正相键合相色谱法特征----固定相极性＞流动相极性分离机制---类似液-液分配色谱的分离原理应用范围---适于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物(如脂溶性维生素、脂、芳香醇、芳香胺等）

（2）反相键合相色谱法特征----固定相极性＜流动相极性分离机制---“疏溶剂作用”理论应用范围-----适用于分离非极性至中等极性的分子型化合物流动相-----有机溶剂流动相-----水+有机调节剂现在是5页\一共有33页\编辑于星期六疏溶剂作用理论利用非极性溶质分子或溶质分子中非极性基团和极性溶剂接触时产生排斥力，而从溶剂中被“挤出”，即产生疏溶剂作用，促使溶质分子与键合相表面的非极性的烷基发生疏水缔合，而使溶质分子保留在固定相中.想一想影响溶质保留（时间长短）的因素有哪些?现在是6页\一共有33页\编辑于星期六（1）溶质分子中非极性部分的总表面积

溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈弱，疏水性越强，保留值越大。（2）键合相上的烷基总面积

烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长，烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大。影响溶质保留（时间长短）的四大主要因素时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯现在是7页\一共有33页\编辑于星期六（3）流动相的表面张力流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱，导致溶质的保留值大。（4）流动相的酸碱性和盐浓度酸性抑制弱酸解离，增加保留时间；碱性抑制弱碱解离，增加保留时间；盐浓度增加不利于离子化溶质保留。现在是8页\一共有33页\编辑于星期六二、离子色谱法1.离子色谱法（IC）离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法2．分离原理[抑制型（双柱型)]

分离柱交换反应：R+-OH-+NaX→R+-X-+NaOH

洗脱反应：R+-X-+NaOH→R+-OH-+NaX抑制柱与组分反应：R—H++NaX→R-Na++HX

与洗脱剂反应：R--H++NaOH→R-Na++H2O在无抑制柱的离子交换色谱中，进入检测器的是高电导的洗脱剂NaOH及被洗脱的组分NaX，后者所产生的电导的微小变化被洗脱剂的高本底所淹没，难于检测。而加了抑制柱后，进入检测器的本底是电导率很低的水，因此很容易检测出具有较大电导率的HX。现在是9页\一共有33页\编辑于星期六2．固定相与流动相（1）固定相基质

---合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶离子交换剂

----键合的离子交换基团类型符号官能团强阳离子交换剂SCX—SO3H弱阳离子交换剂WCX—COOH强阴离子交换剂SAX—N+R3弱阴离子交换剂WAX—NH2现在是10页\一共有33页\编辑于星期六（2）流动相----水缓冲溶液

选择规则(1)增加流动相中盐的浓度，可以降低待测离子的竞争亲和力，使其在固定相上的保留时间减少，先出色谱柱;反之，则保留时间增大，后出色谱柱.（2）pH增大，酸的离解度增大而值增大，保留时间增加，后出柱；但有机碱的离解度降低而分配比减小，保留时间减小，先出柱。(3)缓冲溶液中缓冲剂浓度增大;保留时间会减小。

现在是11页\一共有33页\编辑于星期六三、反相离子对色谱法1．分离机制

在反相色谱法中，将一种或多种与被测离子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到极性流动相中，使其与被测离子结合，形成疏水性（中性或弱极性）的离子对缔合物,而被非极性固定相（有机相）萃取，进入固定相被保留.因待测组分离子的性质不同、反离子形成离子对的能力不同和形成离子对疏水性的不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间的不同，因而出色谱柱先后不同，实现分离.生成离子对反应反离子被测离子现在是12页\一共有33页\编辑于星期六2．常用

离子对

试剂阳离子烷基磺酸或盐类(十二烷基磺酸钠）分析有机碱类和有机阳离子阴离子季铵盐类(四丁基季铵盐、十六烷基三甲基季铵盐

)分析有机酸和有机阴离子3．固定相与流动相(1）固定相

-----ODS等非极性固定相

(2）流动相

-----甲醇-水或乙腈-水体系中加入适量离子对试剂，并用缓冲液调至合适的pH。分离有机碱的pH值一般为3~3.5；分离有机酸的pH值一般在7.5左右。现在是13页\一共有33页\编辑于星期六第2节高效液相色谱仪高效液相色谱仪结构及流程现在是14页\一共有33页\编辑于星期六一、输液系统单柱塞往复泵结构示意图

1．高压输液泵单柱塞往复泵双柱塞往复泵(串或并联）恒压泵(淘汰)恒流泵现在是15页\一共有33页\编辑于星期六2．梯度洗脱装置内梯度----高压泵将溶剂按程序压入混合室，混合后再注入色谱柱外梯度---多元溶剂通过比例阀再由泵注入色谱柱二元内梯度洗脱装置示意图现在是16页\一共有33页\编辑于星期六四元外梯度洗脱装置双泵(串联)工作原理示意图

现在是17页\一共有33页\编辑于星期六3．洗脱方式等度洗脱梯度洗脱想一想分别在何种情况下选择等度或梯度洗脱?二、进样系统1．六通阀进样器现在是18页\一共有33页\编辑于星期六2．自动进样器现在是19页\一共有33页\编辑于星期六三、分离系统1．色谱柱类型常量柱内径2～4.6mm，柱长10～25cm半微量柱：内径1～1.5mm，柱长10～20cm毛细管柱：内径0.5～1mm，柱长30～75mm分析型柱制备型柱内径20～40mm，柱长10～30cm分析型制备型现在是20页\一共有33页\编辑于星期六2．填充剂-----最常用填充剂为化学键合硅胶

四、检测系统1.紫外检测器可变波长检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器结构与光路示意图

现在是21页\一共有33页\编辑于星期六三维色谱图现在是22页\一共有33页\编辑于星期六2．电化学检测器介电型

----测量两电极之间电容介质的介电常数变化测得组分浓度电导型

---测电导率变化来测量电离物质含量电位型

--测定电流为零时电极间的电位差值安培型

---测定电极间的电流变化而测定样品浓度典型电化学检测器示意图

现在是23页\一共有33页\编辑于星期六3．蒸发光散射检测ELSD是基于光线通过微小粒子时会产生光散射的现象蒸发光散射检测器工作原理示意图五、数据记录及处理系统（类似于GC)现在是24页\一共有33页\编辑于星期六现在是25页\一共有33页\编辑于星期六第3节定性与定量分析技术一、定性分析技术1．色谱鉴定法2．两谱联用鉴定法LC-UVLC-MS二、定量测定分析(外标法、内标法）1.加校正因子的主成分自身对照法

(1)校正因子测定与计算现在是26页\一共有33页\编辑于星期六(2）测定测定杂质含量时，按供试品质量标准项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照液，进样，调节检测灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积分。取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样。除有特殊规定外，供试品溶液的记录时间应记录到主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱衅上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。现在是27页\一共有33页\编辑于星期六2．不加校正因子的主成分自身对照法按上述（1）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。除供试品质量标准项下有特别规定外，供试品溶液色谱图记录的时间应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图中各杂质的峰面积并与对照溶液的主成分的峰面积比较，计算杂质的含量。现在是28页\一共有33页\编辑于星期六第4节高效毛细管电泳简介一、毛细管电泳分离原理简介1.电泳流

(电泳)-----在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移2.电渗流

（电渗)

-----在一般性况下（pH＞3）石英毛细管柱内表面带负电，和溶液接触时形成双电层;在高压电场作用下，双电层中的水合阳离子整体朝负极方向移动3.粒子迁移速度电渗流的速度=5~7倍电泳流速度阳离子迁移速度＝电渗速度＋电泳速度阴离子迁移速度＝电渗速度－电泳速度中性粒子迁移速度＝电渗速度现在是29页\一共有33页\编辑于星期六4.分离原理

在一定电场作用下,在毛细管中的各种不同的粒子电泳速度和电渗速度也各不相同，电渗流可以带动阳离子、阴离子和中性物质以不同的速度从阴极端流出而实现分离。二、毛细管电泳仪的基本装置毛细管柱、柱恒温系统、电解液槽、进样器、高压电源、检测器和数据处理器毛细管电泳装置示意图

现在是30页\一共有33页\编辑于星期六1．毛细管柱及温度控制（1）毛细管柱空心柱----区带电泳、胶束电泳及环糊精电泳填充毛细管柱---电色谱壁处理柱----蛋白质电泳（2）毛细管恒温装置作用---消除电泳产生的焦耳热精度---±0.1℃恒温方式高速气流恒温液体恒温现在是31页\一共有33页\编辑于星期六2．高压电源直流电源电压:0~30