微工柠檬酸发酵机制

微工柠檬酸发酵机制第1页/共25页第四章柠檬酸发酵机制2023/4/5‹#›第2页/共25页

重点：柠檬酸生物合成途径

柠檬酸生物合成的代谢调节机制

难点：柠檬酸生物合成的代谢调节机制

2023/4/5‹#›第3页/共25页一、柠檬酸简介柠檬酸又名枸橼酸（jǔyuánsuān），学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗名citricacid，分子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。第一节概述2023/4/5‹#›第4页/共25页食品工业：酸味剂、增溶剂、抗氧化剂、防腐剂，除腥脱臭剂；医药工业：枸橼酸根离子与钙离子能形成一种难于解离的可溶性络合物，因而降低了血中钙离子浓度，使血液凝固受阻。在输血或化验室血样抗凝时，用作体外抗凝药化学工业：鳌合剂，迅速沉淀金属离子美容品、化妆品：加快角质更新，有助于皮肤的中黑色素的剥落，毛孔的收细，黑头的溶解饲料业：可以提早断奶，提高饲料利用率5%～10%，增加母猪产仔量环保：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液用于烟气脱硫二、柠檬酸及其盐的应用概况2023/4/5‹#›第5页/共25页从柑橘提取固态发酵（薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品）液态浅盘发酵（黑曲霉，泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉）深层发酵（黑曲霉/薯干粉）石油（石蜡油）解脂假丝酵母50%提高至80%固定化细胞循环生物反应器发酵技术每生产1t柠檬酸分别消耗2.5～2.8t糖蜜，2.2～2.3t薯干粉或1.2～1.3t蔗糖。人们正在大力开发

2023/4/5‹#›第6页/共25页三、我国柠檬酸生产现状

生产状况：

60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生产厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生物化学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安徽华源生物药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。2023/4/5‹#›第7页/共25页2023/4/5‹#›第8页/共25页第二节柠檬酸合成途径与代谢调控

1940年，Krebs:TCA；

1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶；

1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢；

1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉中存在TCA循环。一、柠檬酸合成途径的发现2023/4/5‹#›第9页/共25页二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径2023/4/5‹#›第10页/共25页黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。

(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。

(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。2023/4/5‹#›第11页/共25页三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制2023/4/5‹#›第12页/共25页

1、磷酸果糖激酶（PFK）：Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节

Mn2+

缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？

当培养基中Mn2+

缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。2023/4/5‹#›第13页/共25页2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA2023/4/5‹#›第14页/共25页（二）三羧酸循环的调节1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：

顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。

顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。2023/4/5‹#›第15页/共25页

3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节

在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。

α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：①TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②α-酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。2023/4/5‹#›第16页/共25页(三)氧对柠檬酸积累的调节乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：(1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。

当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。

2023/4/5‹#›第17页/共25页（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸3醋酸1柠檬酸生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸酵母N源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度AMP抑制NAD-异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量合成并积累。此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸=90：7：3。细胞质中积累大量异柠檬酸。乙醇乙酸2023/4/5‹#›第18页/共25页①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链：解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通。

②丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。小结：

③顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7

同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。

④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。2023/4/5‹#›第19页/共25页（五）柠檬酸发酵的产率1、无CO2固定反应的产率合成1分子柠檬酸需要3分子乙酰辅酶A，也就是需要1.5分子的葡萄糖。理论产率为：192/(180×1.5)=

71.1%2023/4/5‹#›第20页/共25页2、通过CO2固定反应提供C4二羧酸2023/4/5‹#›第21页/共25页四、柠檬酸发酵过程的控制要点（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP畅通无阻。（3）控制培养基中的Fe2+的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。（2）

控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。2023/4/5‹#›第22页/共25页五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：

1.透明圈大的菌株

平板：10%甘薯+2%的琼脂+0.5%CaCO3

诱变后，涂布，透明圈大的则好

2.显色圈大小

平板：麦汁培养基+pH值指示剂

诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好。2023/4/5‹#›第23页/共25页

3.不分解柠檬酸的菌株

不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA