临床色谱质谱检验技术 第六章 色谱质谱技术在临床检验中的应用（二）

临床基因组教研室佘旭辉邮箱：lab-shexuhui@2017.04.12《临床色谱质谱检验技术》第六章

色谱质谱技术在临床检验中的应用LC-MS/MS在25-羟基维生素D检测中的应用色谱质谱技术在生化遗传中的应用色谱质谱技术在治疗药物监测中的应用色谱质谱技术在内分泌疾病检测中的应用功能性肾上腺肿瘤库欣综合征（皮质醇增多症）醛固酮增多症肾上腺性征异常症（先天性肾上腺皮质增生症）

肾上腺髓质肿瘤

嗜铬细胞瘤第六章色谱质谱技术在临床检验中的应用一、先天性肾上腺皮质增生症介绍三、色谱质谱技术在先天性肾上腺皮质增生症检测中的应用主要内容二、临床背景及检测意义《临床色谱质谱检验技术》四、先天性肾上腺皮质增生症的治疗和预后五、小结与思考一、先天性肾上腺皮质增生症介绍《临床色谱质谱检验技术》生理结构

球状带外层，合成盐皮质激素 皮质束状带合成糖皮质激素

肾上腺网状带内层，合成肾上腺雄激素髓质儿茶酚胺激素这些激素均为胆固醇衍生物，需要一系列酶促反应肾上腺解剖图与生理结构先天性肾上腺皮质增生症先天性肾上腺皮质增生症（CongenitalAdrenalHyperplasia，CAH)是一组由肾上腺皮质甾体合成障碍为主要特征的常染色体隐性遗传性病1865年首先由解剖学家DeCrecchio发现了肾上腺皮质功能减退伴肾上腺增生—开始应用CAH命名CAH的重要里程碑—1950年首用皮质醇治疗，1965年明确了细胞色素450系统与21-羟化酶的关系，80年代年克隆了P450的大多数甾体酶的基因总体发生率约1:10,000~1:20,000活产婴儿先天性肾上腺皮质增生症发病机制胆固醇是所有甾体合成的底物，不同酶缺陷发生不同终产物缺乏和中间产物的堆积，致相应临床表现类固醇激素的代谢合成路径图先天性肾上腺皮质增生症发病机制主要是由于合成肾上腺皮质激素所需要的某种或多种酶的先天性缺陷所致，而酶的缺失会导致上游类固醇（底物）蓄积和下游类固醇（产物）耗竭。肾上腺皮质激素合成受阻、分泌不足时，会反馈性地促进促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）及促肾上腺皮质激素（ACTH）释放，从而刺激肾上腺皮质弥漫性增生。促肾上腺皮质激素↑17-羟孕酮↑雄激素↑皮质醇↓主要代谢缺陷终产物低下中间代谢和旁路代谢产物增高肾上腺增生增大肾上腺增生负反馈根据酶缺陷分为以下类型，其中最常见的是21-羟化酶缺陷占90~95%，其次为11-羟化酶缺陷占3-5%；17α-羟化酶和17,20-裂解酶缺乏和3β-羟脱氢酶缺陷，分别占1%左右；其他两种较少见。21-羟化酶缺陷11-羟化酶缺陷3β-羟基脱氢酶缺陷17-羟化酶缺陷17，20碳链裂解酶酶缺陷类脂性肾上腺皮质增生类固醇合成快速反应蛋白先天性肾上腺皮质增生症分类二、临床背景及检测意义21-羟化酶缺陷症（21-hydroxylasedeficiency，21-OHD）终产物缺乏：17-OHP转化为皮质醇↓，孕酮转化为醛固酮↓

中间产物的堆积：17-OHP

和P↑↑旁路代谢亢进：ACTH↑→雄激素（雄烯二酮、睾酮）↑↑21-羟化酶缺陷症—临床分型根据21-羟化酶缺乏程度不同，生化表现，生化异常及基因突变，分为三种类型：经典型（失盐型）经典型（单纯男性化型）非经典型（迟发型）临床表现与醛固酮、皮质醇缺乏的程度和高雄激素的严重程度有关21-羟化酶缺陷症—临床表现失盐型21-羟化酶完全缺乏型(严重型)，约占21-OHD的75%；皮质醇、醛固酮合成障碍因醛固酮严重缺乏导致失盐症状出现，患儿出生1～4周左右出现出现失盐症状，又由于伴有皮质醇合成障碍，出现不同程度的肾上腺皮质功能不足表现，呕吐、腹泻、体重不增、脱水、代谢性酸中毒、难以纠正的低血钠、高血钾，不及时诊治容易导致血容量下降，血压下降，甚至休克，循环功能衰竭该型患儿雄激素增高及男性化程度严重21-羟化酶缺陷症—临床表现单纯男性化型21-羟化酶不完全缺乏，醛固酮合成正常临床上无失盐症状，主要表现为雄激素增高的症状和体征男孩：表现为假性性早熟，出生时无症状，6月后出现性早熟，4-5岁明显，阴茎增大，睾丸不增大，智力正常女孩：表现为假两性畸形，出生时即出现不同程度的男性化体征—阴蒂肥大、不同程度阴唇融合类似尿道下裂，子宫卵巢发育正常男、女孩均会出现体格发育过快，骨龄超出实际年龄；成人后身材矮小，可有皮肤黏膜色素沉着21-羟化酶缺陷症—临床表现非经典型（迟发型）21-羟化酶轻微缺乏常无症状或表现为生后雄性激素过量引起的相应症状。临床表现各异，发病年龄不一，在儿童期或青春期才出现男性化特征。男童为阴毛早现、性早熟、生长加速、骨龄提前，女童可出现初潮延迟、原发性闭经、多毛症及不育症等。11β-羟化酶缺陷症仅次于21-OHD的常见CAH类型（占5%~10%）临床主要表现为低肾素性高血压、低钾血症和高雄激素血症（男性化特征）女性：外阴不同程度的男性化，内生殖器结构正常。未及时诊断和治疗，男性化表现加重，女性呈现异性性早熟，阴蒂增大、多毛、痤疮、嗓音低沉、阴毛和腋毛早现男性：出生时外生殖器正常，未及时诊断和治疗，出现外周性性早熟，如阴茎增大（睾丸不增大）3β-羟类固醇脱氢酶缺陷症罕见类型，占所有CAH小于1%经典型：临床表现为明显的失盐和肾上腺皮质功能不足的症状，出生2周后出现恶心、呕吐、脱水、低血糖、低血钠和高钾血症、代谢性酸中毒等，未及时诊断和治疗，导致循环衰竭死亡；女性婴儿外生殖器正常或不同程度男性化，男性婴儿不同程度性发育不良非经典型：没有失盐症状，男、女性外生殖器正常，有时出现肾上腺功能、阴毛早现17α-羟化酶缺陷症罕见类型，占所有CAH的1%左右因体内积聚过量皮质酮具有部分糖皮质激素效应，通常不会出现明显肾上腺皮质功能低下的临床表现，极少发生肾上腺危象。男性完全或部分女性化外生殖器，尿道下裂、小阴茎、隐睾表现女性表现为性幼稚，性发育延迟、缺乏第二性征发育、原发性闭经、阴毛稀少等新生儿筛查目的：防止新生儿肾上腺危象、休克及其后遗症的产生，降低死亡率；防止女性男性化，减轻过量雄激素作用的后果（包括最终导致身材矮小、性别不明及性心理障碍等）经典失盐型CAH患儿常有危及生命的低钠血症、高钾血症、血容量降低及休克发生，及时诊断并治疗尤为重要。CAH新生儿筛查主要针对经典型21羟化酶进行。国外近年来新生儿筛查逐步推广，CAH患儿发生肾上腺危象已较少见CAH筛查方法--2010年卫生部"新生儿疾病筛查技术规范"筛查方法新生儿CAH筛查是对出生后2~5d的新生儿通过测定干滤纸血片中17-羟孕酮浓度进行21-OHD筛查，该筛查方法约能检出70%经典型21-OHD患儿，而非经典型21-OHD难以通过筛查发现筛查技术采用时间分辨荧光分析法或酶联免疫法测定干滤纸血片中17-羟孕酮浓度二次筛查的必要性由于单纯采用17-羟孕酮浓度进行CAH筛查的假阳性率高，阳性预测值低，使CAH筛查面临高度挑战。二次筛查可提高筛查的特异性，降低假阳性二级筛查方法对17-羟孕酮筛查阳性样本采用LC-MS/MS技术同时测定多种激素，可提高特异性和敏感性，阳性预测值高达30%～100%17-羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质醇，再计算酶反应的底物与产物比值(17-羟孕酮＋雄烯二酮)/皮质醇、(17-羟孕酮＋21-脱氧皮质醇)/皮质醇等该方法还可诊断其他类型CAH，同时可作为监测治疗效果的一种手段二级筛查(second-tierscreening)三、色谱质谱技术在先天性肾上腺皮质增生症检测中的应用分析方法进展传统方法（放射性免疫分析法和酶联免疫吸附分析法）存在基质干扰、抗体交叉反应，导致方法特异性、准确度和可靠性均较差；作为筛查方法时，假阳性率较高，筛查阳性的确诊阳性率低（仅1/100）部分免疫学方法间缺乏结果的一致化和标准化；一次检测只能测定一种激素分析方法进展气相色谱质谱法（GC-MS）样品制备过程复杂繁琐液相色谱质谱法（LC-MS/MS）高特异性、高灵敏度（低值准确）；可避免交叉反应同时检测17-OHP和其他多种激素（包括前体和代谢物），提高诊断灵敏度分析测定方法检测准备取样添加内标与硫酸锌混匀离心上清液上样淋洗洗脱氮气吹干复溶样品前处理方法取曲线、质控品、人血清样品于洁净离心管中加入内标与硫酸锌后，震荡加入甲醇，剧烈震荡，离心上清液加入到处理好的OASISHLB固相萃取柱（依次使用乙腈、甲醇、水平衡）中，依次使用水、30%甲醇水除杂，最后使用乙腈洗脱洗脱液氮气吹干，后加入复溶剂（甲醇/水：50/50）色谱方法（WatersAcquityUPLCH-class超高效液相色谱仪）色谱柱：BEHC18色谱柱（1.7μm,100×2.1mm）柱温为40℃，流速为0.3mL/min，样品进样量为10μL，自动进样器温度为10℃流动相A：5mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B：甲醇梯度洗脱程序如右图分析测定方法时间（min）B%0.0351.5353.0457.0639.010011.51001435质谱方法（WatersXevoTQS三重四级杆质谱仪）ESI正离子模式（DHEAS为负离子模式）；MRM扫描模式毛细管电压3.5kV，锥口电压4～60V，碰撞能15～34eV，驻留时间0.03～0.1s；去溶剂温度500℃，去溶剂氮气流量790L/h，离子源温度150℃，锥口氮气流量145L/h，碰撞器氩气流速0.14mL/min分析测定方法同时测定单个样品中多种类固醇激素的含量分析测定方法数据处理分析测定化合物（1）盐皮质激素：11-脱氧皮质酮(DOC)、皮质酮(B)、18-羟皮质酮(18OHB)、醛固酮(Aldo)（2）糖皮质激素：11-脱氧皮质醇(S)、皮质醇(F)、可的松(E)、（3）孕激素：孕酮(PG)、17-羟孕酮(17OHP)、（4）雄激素：雄烯二酮(D4)、睾酮(T)、硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、（5）其他：18-羟-11-脱氧皮质酮(18OHDOC)、21-脱氧皮质醇(21DF)和11-脱氢皮质酮(A)先天性肾上腺皮质增生症的诊断生化检测临床表现非经典型21-OHD的诊断非经典型21-OHD患者睾酮和雄烯二酮、脱氢表雄酮可以有所升高，但低于经典型。轻度升高的睾酮常成为唯一线索，但不能作为诊断依据。与经典型不同，血ACTH的升高及皮质醇的降低均不明显。其特异性诊断指标血清17-OHP浓度随机测定时也多数在正常范围，仅清晨测定有所升高。单次血清17-OHP浓度主要用于临床筛查，筛查的异常人群应进行ACTH兴奋试验进一步诊断。非经典型21-OHD的诊断ACTH兴奋试验方法静脉推注ACTH（1-24肽）0.25mg，注射前（基础值0）注射后60min后取血测17OHPACTH兴奋后17OHP17OHP＜1500ng/dL，可能为21羟化酶杂合突变，无须进一步治疗，但应随访17OHP＞10000ng/dL，多为经典型CAH，需要糖、盐皮质激素治疗17-OHP在1500ng/dL~10000ng/dL之间多为非经典型CAH，如有症状，应进行氢化可的松治疗；无症状者需密切随访四、先天性肾上腺皮质增生症的治疗和预后《临床色谱质谱检验技术》治疗目标：防止肾上腺危象和抑制高雄激素状态，延缓骨成熟，促使正常生长和青春发育治疗原则：严密监测各激素水平，控制在合理范围，又要防止皮质醇过量导致医源性库欣综合征及生长抑制的目标（治疗不当与治疗过度均可导致矮小及生理心理发育障碍等后遗症）21-羟化酶缺乏症的治疗21-羟化酶缺乏症的治疗随访出生后拒乳、呕吐、腹泻、脱水和酸中毒，低血钠、高血钾甚至循环衰竭、苍白、抽搐。多有色素沉着（阴囊、大阴唇、乳晕）女孩出生时多男性化，阴蒂肥大、大阴唇融合似阴囊、阴道尿道共同开口等畸形。男孩出生6个月后体格发育快，4~5岁性早熟，骨骼提前，智力正常相关实验室检查确诊排除治疗一般治疗：①纠正脱水及电解质、酸碱平衡紊乱紊乱②补充氯化钠药物治疗：①糖皮质激素治疗②盐皮质激素治疗③急性肾上腺皮质功能危象处理其他治疗：外生殖器矫形治疗（主要针对女性假两性畸形的手术治疗）糖皮质激素（皮质醇）：治疗剂量和剂型因不同类型、不同生长时段而异（生长发育期使用氢化可的松；已达成年身高的可个体化使用长效皮质醇制剂，如泼尼松、泼尼松龙、地塞米松等）盐皮质激素：对失盐型患者，需联用盐皮质激素（如氟氢可的松），2岁以下患儿还需补充氯化钠危象发作处理：静脉给予大剂量氢化可的松，补充足够钠盐纠正低血钠；休克处理时不宜给予地塞米松，不能纠正低血钠和危象21-羟化酶缺乏症的治疗应激情况处理：如发热、感染、手术或外伤等情况需增加氢化可的松剂量，